大豆磷脂微生物限度检查法验证

1、大豆磷脂微生物限度检查法验证验证文件大豆磷脂微生物限度检测方法验证起草人起草日期审核人审核fi期批准人批准日期文件编号目 录1适用范围-1-2 i的概述14验证所需要的仪器设备及文件可接受的限度范围标准-2-6测试方法57异常情况处理-15-8测试结果-159结论-15-10再验证周期-16-附表1适用范围本验证方案适用于大豆磷脂微生物限度检查法的验证。2目的建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试 验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。3概述3丄按中国药典2010年版附录xi j微生物限度检查法方法的“供试品的制备”项下制备方法2 （固体、半固体或黏稠液供试品，取供 试品

2、10g,加ph7.0无菌氯化钠蛋白腺缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他 适宜的方法，混匀/乍为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置 水浴中适当加温使供试品分散均匀）制备。按“细菌，霉菌，酵母菌计 数”项下检查法平皿法进行细菌，霉菌及酵母菌的计数方法验证。按控 制菌的检查法进行控制菌检查法验证。验证试验使用一批产品进行三次独 立平行试验。3.2验证时间： 年 月日至u年 月 日3.3验证产品批号：4验证所需要的仪器设备及文件4.1验证需用仪器设备4.2验证所需要的文件及存放地方5可接受的限度范围标准5.1大豆磷脂微牛物限度检查质量标准5.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断在3次独立

3、的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%o 若试验组的菌回收率均不低于70%,照该供试液制备方法和计数法测定供 试品的细菌、霉菌及酵母菌;若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%, 应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。5.3控制菌检查方法验证结果判断若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品 的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的 抑菌活性，并重新进行验证。5.4大肠埃希菌检查结果判断如mug阳性、靛基质阳性，判供试品检出人肠埃希菌；如mug阴性、 靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如mug阳性、靛基质阴性， 或mu

4、g阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于 曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824h。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符， 判定供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形 态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的牛化试验，确 认是否为大肠埃希菌。-2-当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验mug呈阳性，供试品mug 阳性、靛基质阳性，报告lg或i ml供试品检出大肠埃希菌。mug阴性、 靛基质阴性，报告lg或im i供试品未检出大肠埃希菌。mug阳性、靛基质阴性、i m v i c试验为一 +、革兰阴性杆菌，报

5、告lg或im i供试品检出大肠埃希菌;mug阴性、靛基质阳性、imvic 试验为+ + 、革兰阴性杆菌，报告i g或i m i供试品检出大肠埃希菌。供试品培养物检查不符合二项中的任一项，报告i g或i m i供试品未 检出大肠埃希菌。当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠埃希菌， 不能做出检验报告。5.5沙门菌检查结果判断供试品培养物为革兰阴性杆菌，三糖铁琼脂反应及生化反应符合沙门 菌属反应，沙门菌属0多价1血清凝集试验阳性反应（含待检培养物经100°c 30min处理后凝集试验为阳性反应），报告10g或10ml供试品检出沙门菌。供试品培养物三糖铁琼脂反应或生化反应不符

6、合沙门菌属反应及沙 门菌属0多价1 h1l清凝集试验为阴性反应（含待检培养物经100°c30min 处理后凝集试验为阴性反应），报告lg或iml供试品未检出沙门菌。供试品培养物出现下列情况应继续鉴定或保留菌种送交有关单位进 一步鉴定后，再作报告。供试甜培养物牛化反应符合沙门菌属反应，沙门菌属0多价1血清 凝集试验阴性反应。供试品培养物生化反应不符合沙门菌属反应，沙门菌属0多价1血清凝集反应呈阳性反应。对己检出沙门菌的供试品分离菌种，有条件者，应进一步作菌型鉴定。 根据检出菌的特性，推断可能菌型，增加牛化试验项目及沙门菌单因子血淸 “0”及“h”凝集试验进行鉴定。-3-5.6铜绿假单胞

7、菌检查结果判断供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆 为阳性者，即报告lg或iml供试品检出铜绿假单胞菌。供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓 菌素试验阴性时，英硝酸盐还原产气试验、42°c生长试验及明胶液化试验 皆为阳性时，亦报告lg或iml供试品检岀铜绿假单胞菌。凡与以上两种结果不符时，报告lg或iml供试品未检出铜绿假单胞菌。5.7金黄色葡萄球菌检查结果判断如果革兰染色镜检结果清晰可靠（必要时加做已知革兰染色镜检结果 的细菌进行染色质量控制)，凝固酶试验阴性对照试验呈阴性，阳性对照 试验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理：

8、疑似菌革兰染色镜检呈阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性反应者，报告lg 或iml供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是 葡萄球菌属的其他菌种)。革兰染色镜检镜检不是革兰阳性球菌,或血浆凝固酶试验阴性反应，报 告lg或iml供试品禾检出金黄色葡萄球菌。阴性对照有菌生长，试验结果无效。阳性对照试验呈阴性结果，应当加做验证试验，考察检品是否有抑菌 活性。46测试方法6.1供试品大豆磷脂，批号。6.2培养基及菌种6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，中国药品生物制品检定所 制。6.2.2枯草芽抱杆菌cmcc(b)63501>金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003> 大

9、肠埃希菌cmcc44102、口色念珠菌cmcc(f)98001> 黑曲霉cmcc(f)98003、乙型副伤寒沙门菌cmcc50094、 铜绿假单胞菌cmcc(b)101046.3菌液制备631细菌、霉菌及酵母菌检查的菌液制备6.3.1.1取新鲜的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽泡杆菌的培养 物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经3035°c培养1824h,用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50loocfu的菌悬液，做活菌 计数备用。6.3.1.2取新鲜的白色念珠菌的培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼 脂培养基中，经2328°c培养2448h,用0.9%

10、无菌氯化钠溶液制成每 lml含菌数为50loocfu的菌悬液，做活菌计数备用。6.3.1.3取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，经2328°c培养57d,加入35ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液，将霉菌鞄了洗脱。然后吸出抱了悬液(用管口带有薄的 无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50 loocfu的菌悬液，做活菌计数备用。6.3.2控制菌检查的菌液的制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌 培养物少许，接

11、种至10 ml营养肉汤培养基内，置30?35°c培养18?24h, 取均匀培养物lml,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每lml含菌10?ioocfu的 菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养 后计数确定。6.3.3供试品制备取供试品10g,加ph7.0无菌氯化钠蛋白腺缓冲液至100ml,制成1：10的供试液。6.4验证试验方法细菌、霉菌及酵母菌检验方法验证采用上述供试品，进行3次平行试 验，分别人工5污染上述5种代表试验菌株。控制菌检验方法验证采用上述批供试品 进行实验。641细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证试验6.4.1.1试验分组6.4.1.1.1供试品

12、对照组：取上述供试液lml,按菌落计数方法测定供试甜本底细菌数；取上述供试液lml,按菌落计数方法测定供试品木底霉菌和酵母菌数;6.4.1.1.2菌夜组：分别取上述5种试验菌悬液lml，按菌落计数方法测定所加试验菌数。6.4.1.1.3 试验组：flxi： 10供试液lml注入无菌平皿，分别加入大肠埃希菌、金黄色葡 萄球菌、枯草芽泡杆菌试验菌悬液各lml,按平皿法测定其菌数。取10供试液lml注入无菌平1111,分别加入白色念珠菌和黑曲霉悬 液各lml,按平皿法测定霉菌数。6.4.1.1.4稀释剂对照组：取实验用的稀释液lml代替供试甜，加入实验菌，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。6.4.1

13、.2验证试验操作6.4.1.2.1取供试品10g,加ph7.0无菌氯化钠蛋白腺缓冲液至100ml, 制成h 10的供试液。取上述供试液lml,注入无菌平ill!中，注入15?20ml 不超过45°c的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出 粉月东葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。6.4.1.2.2阴性对照试验取实验用的稀释液lml,注入无菌平皿中，注入15?20ml不超过45°c 的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉腺葡萄糖 琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养，均不得有菌生长。6.4.1.2.3培养和计数 细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天

14、，逐日 观察菌落牛长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至57 天进行菌落计数报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后, 计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释 级别两个平板的菌落平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍 或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠培养基用于霉菌及酵母 菌计数；酵母浸出粉月东葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若 营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌, 则应分别点计霉菌和酵母菌，细菌菌落数。然后将营养琼脂上的霉菌和酵 母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上细菌数与玫瑰红钠琼脂培养基

15、上的霉菌和 酵母菌或营养琼脂培养基上的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的 菌落数为计数结果。6.4.1.3菌数报告规则以相当于lg供试品的菌落数报告菌数；若无菌落生长，以<l报告 菌数，或<l乘以稀释倍数的值报告菌落数。6.4.1.4计算公式试验组平均菌落数一供试品对照组平均菌落数试验组的菌回收率x 100%菌液组的平均菌落数6.4.2控制菌的检查验证试验6.4.2.1大肠埃希菌试验组：取1： 10供试液10ml和大肠埃希菌悬液lml,接种至100ml 胆盐乳糖培养基中。供试品组：取1： 10供试液10ml,接种至200ml胆盐乳糖培养基中。阳性对照试验：取大肠

16、埃希菌悬液lml,同供试品的控制菌检查法检 查。阳性对照试验应检出大肠埃希菌。阴性对照试验：取稀释液10ml,照相应控制菌检查法检查，作为阴性 对照。阴性对照应无菌生长。大肠埃希菌的试验：按上述分组接种至100ml胆盐乳酸培养基中，3035°c培养18-24小时，必要时可延长至48h。取上述培养物0.2ml,接种至含5mlmug培 养基的试管中，培养，于5h、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种 的mug培养基作为本底对照。若管内培养物呈现荧光，为mug阳性；不 呈现荧光，为mug阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液， 液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛

17、基质阴性。本底对照 应为mug阴性和靛基质阴性。如呈现mug阳性、綻基质阴性或mug阴性、靛基质阳性时，应 将上述供试品bl增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1?2环培养液划线 于emb或麦康凯琼脂平板上，培养18?24ho若平板上无菌落生长、或生 长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。 当阳性对照的平板7呈典型菌落生长时，若emb或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1 所列菌落形态特征相符或疑似者，应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色 镜检和im vi c试验，确认是否为大肠埃希菌。如emb或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列特征相符或疑 似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌

18、落的表面中心，沾取培养物，应挑 选2?3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18?24h,作以下检査。 如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应 沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于emb琼脂平 板，培养18?24h,再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。革兰染色镜检、镜检 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均勻涂片，自然或微温，再通过火焰2?3次干燥 使固定。滴加结晶紫染液，染色imin,水洗。滴加碘液，媒染imirvk洗，以滤纸吸干余水。滴加9 5%乙醇，脱色20?30s,至流出液无色，水洗。滴

19、加沙黄染液，复染imin,待干后，镜检。染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色;革兰阴性菌呈红色。大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。生化试验乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24?48h, 观察产酸(指示剂为酸性品红者为红色;指示剂为漠麝香草酚蓝者为黄色), 产气(小倒管内有气泡，气泡无论大小都是产气)。为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管。绝大多 数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24h出现阳性。或适当延长培养时间。靛基质试验(i)取上述斜面培养物，接种于蛋白月东水培养基，培养24?4 8h,沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性， 呈试

20、剂木色为阴性。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。一般24h即 可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2 m i培养液进行检查， 如錠基质是阴性，余下的蛋白腺水培养物再培养2 4h,作靛基质试验。甲基红试验(m)取上述斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖月东水培养基 中，培养48 ± 2 h,于培养液中加人甲基红指示液2 ?3滴（约每ml培养 液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈 黄色为阴性。乙酿甲基甲醇生成试验（vp）取上述斜曲培养物，接种于磷 酸盐葡萄糖月东水培养基中，培养48±2h,于2ml培养液中加入cr蔡酚乙 醇试液iml,混匀，再加4

21、0 %氢氧化钾试液0.4ml洗分振摇，在4h（通常在 30min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。枸椽酸盐利用试验（c）取上述斜面培养物，接种于枸椽酸盐培养基 斜面上，培养2 ?4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时 为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。&4.2.2沙门菌试验组：取:10供试液10ml和沙门菌悬液lml,接种至200ml营养 肉汤培养基中。供试品组：取1： 10供试液10ml,接种至200ml营养肉汤培养基中。 阳性对照试验：取沙门菌悬液lml,同供试品的控制菌检查法检查。阳性对照试验应检出沙门菌。阴性对照试验：取稀释液10ml,照相应控制菌

22、检查法检查，作为阴性 对照。阴性对照应无菌生长。沙门菌的试验：按上述分组，30?35°c培养18?24 h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮 透明，无菌牛长。轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别吸取iml接种于1管含10ml四硫磺酸钠亮绿培养基的试管中，培养18?24ho轻微 摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照瓶，分别以接种环沾取1?2环培养液接 种于胆盐硫乳琼脂（dhl）或沙门菌志贺菌琼脂（ss）平板及曙红亚甲蓝（emb） 琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24?48h,必要时延长至40?48ho 检查平板上有无疑似沙门菌菌落。初步鉴别试验从每个供试甜的分离平板上挑取2?3个疑似菌

23、落（菌落形态特征与表 3所列的形态特征相符或疑似）分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接 种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜曲（或者 克氏双糖铁琼脂斜面）并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养18?24h, 观察结果。9疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应为：斜面红色（产碱），底 层黑色（产h2s）并显示黄色（产酸）；斜血红色，底层黄色;斜面黄色， 底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼 脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜 面黄色并同时底层无黑色，斜面未见红色底层未见黄色，或斜面及底层均 为红色者可以排除沙门菌。将

24、疑似沙门菌的三糖铁琼脂或营养琼脂斜面 培养物作生化试验，血清凝集试验及革兰染色镜检,镜检。沙门菌应为革兰 阴性杆菌。生化试验靛基质试验用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白腺水培养基中，照 大肠杆菌检査法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应。腺酶试验用接种环沾取少许培养物，划线接种于服琼脂斜面，培养2 4 h '观察结果。斜面变为红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应。氤化钾试验将培养物先接种至营养肉汤培养基中培养20?24h,用接种 环沾取培养液1环，接种至氧化钾培养基内，另取一环培养液接种于不 含氧化钾的同样培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养24?48h, 观察结果。

25、对照管内有菌牛长（混浊），而试验管也有菌牛长为阳性反应； 对照管有菌生长（混浊）而试验管无菌生长（清亮）为阴性反应。沙门菌 应为阴性反应。本试验应十分注意密封管口，夏天分装培养基宜在冰浴 中进行，防止鼠化钾分解，产生氢氤酸逸出，致使培养基内鼠化钾浓度降 低，不能抑制细菌生长，造成假阳性。氤化钾为剧毒品、操作时须谨慎, 切勿用口吸液。用后的培养基每管加数粒硫酸亚铁和20%氢氧化钾0.5ml 去毒。然后再灭菌、洗涤。赖氨酸脱竣酶试验用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱竣酶培 养基中，同吋接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24?48 h观察结果。对照管黄色（产酸），试验管呈紫色为阳性反

26、应（赖氨酸脱竣产 碱）；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应。动力试验用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养 24h,观 察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养 基呈混浊现象;无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈 清晰透明状;无动力表现的培养物，应在室温保留2 ?3天后，再行观察。 沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动，动力 试验阳性。沙门菌生化反应的初步鉴别见下表。-10-针对三糖铁琼脂上的反应，+产酸潢色），阳性，阳性率，>90%; 产碱（红色），阴性，阴性率，> 9 0 % ; +

27、/ 一多数阳性、少数阴性；+ s产 生少量气体;+阳性，阳性率，> 9 0 %广阴性，阴性率,> 9 0%;+/-多 数阳性、少数阴性，一/+多数阴性、少数阳性（本表依据何晓青卫生防 疫细菌检验，参考第八版美国临床微牛物手册）；反应序号1除典型反 应外，腺酶、氧化钾试验、赖氨酸脱竣酶试验三项中有一项异常；反应序 号2仅靛基质阳性;可结合血清学凝集试验，或加做部分生化试验，判定是 否为沙门菌，其他情况可排除沙门菌。血清学凝集试验准备1片洁净的灭菌载玻片，在近中央的一端，以直径3mm接种环 沾取沙门菌属0多价1血清2?3环制成与玻片横径相垂直的条形涂抹， 长约1.5cm

28、,宽约0.5cmo另一端用生理盐水代替血清同法操作，作为阴 性对照。用接种环分别挑取三糖铁琼脂斜面或营养琼脂斜面的新鲜培养物少 许，在血清和盐水中混匀。菌量要适当，勿过浓。将玻片前后倾斜数次，以喑色背景衬底，在良好的照明条件下进行观 察，阴性对照不出现凝集现象，试验组任何程度的凝集现象都是阳性反应。 阳性反应通常在3min内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻培养皿内,并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min,再观察结果。如果仍然没有岀现凝集，应取斜面培养物，置含少量生理盐水的试管中，制成 浓菌悬液，在100。c水浴屮保温30min,以除去可能存在的v i抗原，待 冷，再做凝集试

29、验，如出现凝集/乃判为阳性反应;如不出现凝集现象，则 为阴性反应。如对照试验出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理 后再作凝集试验。6.4.23铜绿假单胞菌试验组：取1： 10供试液10ml和铜绿假单胞菌悬液lml,接种至100ml 胆盐乳糖培养基屮。供试甜组：取1： 10供试液10ml,接种至100ml胆盐乳糖培养基中。阳性对照试验：取铜绿假单胞菌悬液lml,同供试品的控制菌检查法 检查。阳性对照试验应检岀铜绿假单胞菌。阴性对照试验：取稀释液10ml,照相应控制菌检查法检查，作为阴性 对照。阴性对照应无菌生长。铜绿假单胞菌的试验：按上述分组，于30?35°c培养18?2

30、4h（必要时可延至48h）。阴性对照菌 应无菌生长。轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1?2环培养液（如有 菌膜应挑取之），划线接种于澳代十六烷基三甲胺琼脂平板，于30?35°c培 养18?24ho铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无 定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象,在菌落相邻处 常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色, 但亦有不产色素的菌株。菌落述有粗糙型和黏液型等，应注意挑选。纯培养供试品分离平板生长典型菌落或呈疑似菌落时，以接种计轻轻接触单 个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2?3个疑似菌落，分别接种营养 琼脂斜

31、面,培养，作以下检查。革兰染色镜检铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽泡杆菌，单个，成对或成短链排列。 生化试验可用铜绿假单胞菌（cmcc（b） 10104）做生化试验的阳性对照株。氧 化酶试验12取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面 培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1滴新配制的1%二盐酸二甲基对 苯二胺试液，在30s内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色, 即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。本试验应注意：（1 ）试验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反应结果不可靠。（2）试验避免与铁、镰等金属接触，不可用普通接种计（环）（白金材 料除外）挑取菌（苔

32、），否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。（3 ）试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可 用。（4）反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使 之与空气隔绝，造成假阴性反应。(5 )麦康凯、s s培养基等含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验, 因为糖分解产酸抑制氧化酶活性。绿脓菌素试验取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基(pdp )斜面上, 30?35° c培、养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内加三氯 甲烷3?5m i,以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全 萃取在三氯甲烷内。静置片刻，待三氯甲烷分层，用吸管将三氯

33、甲烷移至 另一试管中，加入盐酸试液(imol/l)约lml,振摇后静置片刻，如在盐酸 液层内岀现粉红色、即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。本试验可 用未接种的p d p琼脂培养基斜面作阴性对照，阴性对照试验应当呈阴性。 如培养基斜面无色素产牛，应于室温培养1?2天再按上法试验。凡经再次 检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。硝酸盐还原产气试验以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐腺水培养基中, 置30?35° c培养24h,观察结果。如果在培养基内的小倒管中有气体产生， 即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐'并将亚硝酸盐分解产生氮气。 小倒管内无气泡者为阴

34、性反应。42° c生长试验以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0.9 %无菌氯化钠溶液中， 制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置41。c 士 1° c的恒温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养24?48h,斜面如有菌 苔生长者为阳性反应;无菌苔生长为阴性反应。明胶液化试验以接种计沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培养基中, 穿刺深度应接近培养基的底部，于30?35° c培养24h。取出放入0?4° c 冰箱内10?30mino如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应;如明 胶呈凝固状，为阴性反应。本试验应注意：(1)本试

35、验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之 凝固后，再穿刺接种。(2 )试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观 察结果。6.4.23金黄色葡萄球菌试验组：取1： 10供试液20ml和金黄色葡萄球菌悬液:lml,接种至100ml营养肉汤培养基中。供试品组：取1： 10供试液10ml,接种至200ml营养肉汤培养基中。阳性对照试验：取金黄色葡萄球菌悬液lml,同供试品的控制菌检查 法检查。阳性对照试验应检岀金黄色葡萄球菌。阴性对照试验：取稀释液10ml,照相应控制菌检查法检查，作为阴性 对照。阴性对照应无菌牛长。金黄色葡萄球菌的试验:按上述分组，置30?35°

36、c培养18?24h（必要时可延至48h）0阴性对照应 无菌生长。将上述供试品增菌培养液，以接种环沾取1?2环培养液，划 线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30?35°c培 养24?72ho当供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于金黄色 葡萄球菌特征，可报告为ig或iml供试品未检出金黄色葡萄球菌。纯培养当供试品分离平板生长菌落与表1所列菌落特征相似或疑似时，应选 取2?3个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心表血培养物，接 种于营养琼脂斜面上，于30?35° c培养18?24h,取营养琼脂斜面培养物 作革兰染色、镜检及接种营养琼脂肉汤于30?35。c培养18?2 4 h做血浆 凝固酶试验。革兰染色、镜检-14 -