发酵工艺学复习

1、如有帮助欢迎下载支持发酵工艺学概论复习1. 发酵技术的概念和特点概念：发酵技术是利用微生物的生长和代谢生产各种有用生物、化学产品的技术现代发酵技术的特点：产品类型多、技术要求高、规模巨大、技术发展速度快2. 相对于化学反应过程，微生物反应具有以下的优点：1) 反应在常温、常压下进行，对设备的要求较低。2) 原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，价格相对低廉。3) 反应以生命体的自动调节方式进行，能在单一反应器 ( 发酵罐 ) 内很容易地进行。4) 生产过程相对安全，对人体危害小。5) 通过对微生物的菌种改良，能够利用原有设备使生产飞跃。3. 发酵工业存在的问题 ( 发酵过程存在的问题和缺陷 )

2、1) 底物不可能完全转化为目标产物，副产物的产生不可避免，造成产物提取和精致的困难。2) 微生物反应是活细胞的反应，菌体易发生变异和退化，微生物反应过程复杂，对发酵过程的控制相当困难。3) 原料是农副产品，虽然价廉，但质量和价格波动较大。4) 与化工过程相比，反应器的效率低。5)发酵废水量大，并含较高的COD 和 BOD ，需要进行处理。6) 生产过程易受杂菌污染7) 发酵过程的控制相当困难4. 发酵工业 ( 技术 ) 发展简史现代发酵工业以青霉素(penicillin)的大规模液体深层培养为标志。1928 年 Fleming发现了青霉素，1940 年 Florey和 Chain 成功制 备青

3、霉素并进行临床实验。5.发酵技术的应用1)在医药行业的应用a 能生产四种类型的产品：各种抗生素，各种氨基酸、维生素、基因工程药物b 希望能写出几种常用抗生素的名称：抗细菌的抗生素：青霉素、头孢菌素、红霉素、链霉素、螺旋霉素、四环素、万古霉素、链阳性菌素等抗真菌的抗生素：两性霉素、灰黄霉素、制霉菌素、杀假丝菌素、多效霉素抗肿瘤抗生素：放线菌素，博来霉素，阿德里亚霉素，阿霉素，丝裂霉素各种氨基酸：几乎所有的氨基酸都可以由微生物发酵制备或由微生物产生的酶合成维生素：维生素B2、维生素C、维生素B12,麦角固醇( 维生素D2的前体 )基因工程药物: 干扰素EPO) 、集落刺激因子(interferon

4、)、生长激素、白细胞介素 ( interleukin)(colony stimulating factor, CSF)、单克隆抗体、表皮生长因子、 促红细胞生长素 (monoclonal antibodies, MAbs)(erythopoietin,2)在化学工业中的应用由发酵法生产的有机溶剂由发酵法生产的有机酸：乙醇 (ethanol): 乙酸 (acetic acid)、丙酮 (acetone) 、丁醇 ( butanol) 、二羟基丙酮、丙酸 (propio nic acid)、乳酸 (lactic acid)(dihydroxyacetone)等、丁酸 (butyric acid)等

5、3) 在酶制剂行业的应用写出几种工业酶制剂的名称 :淀粉酶、糖化酶、半乳糖苷酶、葡萄糖异构酶、纤维素酶等蛋白酶：包括碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶脂肪酶果胶酶青霉素酰化酶、青霉素扩环酶等医药工业、轻工业用酶2 微生物的代谢调节微生物代谢调节的生化基础1) 酶活性调节的生化基础：别构效应( 反馈抑制 )2) 酶合成调节的生化基础：酶的诱导和阻遏微生物代谢调节的方式酶的诱导：酶诱导(enzyme induction)的定义生物与一种化学物质诱导物(inducer)相接触的结果大大增加了酶的合成速率。或者说是在化学物质诱导物的作用下，微生物在转录的水平上提高酶的合成速率。安慰诱导物分解代谢物阻遏

6、：微生物与容易同化的碳源相接触，使有些酶合成速率相对降低的作用反馈调节：微生物细胞内分解代谢的酶通常由诱导作用和分解代谢物的阻遏作用进行调节，而合成代谢的酶则通常由反馈调节作用进行调节反馈调节的类型反馈抑制(fedback inhibition)：生物合成途径的最终代谢产物抑制该途径的前面第一或第二个酶的催化活性反馈阻遏(fedback repression)：生物合成途径的最终代谢产物极其衍生物在转录的水平上抑制该途径的几乎所有酶的生物合成反馈抑制和反馈阻遏的区别与联系区别：反馈抑制是从酶水平上进行调节；反馈阻遏从转录水平上调节反馈阻遏作用的响应比较慢；反馈抑制的调节速率比较快反馈抑制的调节

7、对象一般为别构酶，而反馈阻遏的调节对象则不一定反馈抑制一般调节某一代谢途径前面第一或第二个酶的活性或某一分枝代谢途径的第一个酶；而反馈阻遏调节的为代谢途径几乎所有的酶联系：两者的作用相辅相成，联合作用可以对微生物的代谢途径进行效的调节二者所起的作用都是防止代谢产物的过度合成能荷的调节：能荷 (energy charge, EG)反映细胞内的能量状态，可用上式表示，显然当细胞内的腺苷磷酸全为ATP 时，细胞的能荷为 1，当全为AMP 时，细胞的能荷为0。在对数生长期大肠杆菌的能荷为0.8 ，在稳定期逐渐降至0.5 ，当能荷低于0.5时细胞开始死亡分枝代谢途径中的反馈抑制作用( 了解其在发酵中的应

8、用，及其简图)同工酶反馈调节同工酶 ( isoenzymes) 的特异性调节催化同一反应但结构不同的几种酶的总称 大肠杆菌天冬氨酸族氨基酸合成途径中的三种天冬氨酸激酶分别受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的反馈调节协同反馈调节协同(synergitic)反馈调节单个代谢终点产物对代谢途径第一个酶的反馈抑制作用很小，多个终点产物协同作用则可以有效地反馈抑制酶的活性累积反馈调节累积(additive)反馈调节在分枝代谢产物合成途径中，每一终点代谢产物能够部分地抑制合成途径的第一个酶，多种代谢产物多酶活性的反馈抑制具有累加的效果顺序反馈调节顺序反馈抑制在分枝合成代谢途径中， 代谢的终点产物不能直接反馈抑制第

9、一个合成酶的活性， 而是首先抑制分枝步骤的酶活性， 使分枝点上中间代谢产物积累，然后分枝点上的代谢产物在抑制整个途径第一个酶的活性联合激活或抑制联合激活或抑制两个合成代谢途径的共同中间体的合成酶同时受到这两个代谢途径的中间产物或终点产物的激活或抑制分枝代谢途径中的反馈阻遏作用终点代谢产物的反馈阻遏在微生物的合成代谢途径中代谢的终点产物对该途径多种合成酶均有反馈阻遏作用以天冬氨酸族氨基酸合成途径的反馈调节为例 不同微生物中调节机制的多样性： 同一种酶在不同的微生物中受不同的反馈抑制调节 同一种酶的合成在不同的微生物中受不同诱导物的调节根据微生物代谢调节的基本原理提高初级代谢产物产量的方法初级代谢

10、产物的概念初级代谢产物是微生物在生长过程中产生的为菌体生长所必须的小分子化合物， 包括单糖氨基酸、 核苷酸维生素以 及用来合成这些物质的小分子物质与微生物的生长过程耦联一般为微生物的生长过程必须初级代谢产物有：氨基酸、有机酸、单糖、糖酵解途径小分子物质( EM)的中间产物、三羧酸循环(Crebs cycle)的中间产物、磷酸戊糖旁路途径 ( PP)的中间产物等提高初级代谢产物合成的主要方法：减少抑制性和阻遏性的终点产物合成降低微生物对反馈作用的敏感程度减少其它分枝代谢途径产物的合成避开固有的反馈调节a、 中间代谢产物的积累：简单的代谢途径分枝代谢途径b、 终点产物的积累：以谷氨酸棒杆菌发酵生产

11、赖氨酸为例， 与前面所讲的大肠杆菌内天冬氨酸族氨基酸合成途径的调节不同， 在谷棒杆 菌内只有一种天冬氨酸激酶，而且这中酶只受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制调节 除了阻断高丝氨酸合成途径外，工业发酵中的赖氨酸产生菌还具有下列特点：如有帮助欢迎下载支持解除赖氨酸对合成天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的阻遏作用赖氨酸分枝的头两个酶不受赖氨酸的抑制和阻遏L-赖氨酸脱羧酶缺失c、耐反馈作用的突变株的筛选1)抗代谢类似物突变株(mutants)的筛选原理： 将与目标产物具有相似化学结构的类似物加入到培养基中， 类似物可抑制和阻遏合成途径的关键酶但不能被绝大多数微生物因缺少目标产物而死亡， 只有对反馈抑制和反

12、馈阻遏不敏感的突变株能继续合成 目标产物而存活。步骤：菌种诱变、抗代谢类似物的突变菌株的筛选 对代谢类似物的要求：微生物利用，导致a。与目标产物的化学结构相似，能够选择性地抑制和阻遏目标产物合成途径中的关键酶，不b。能被微生物利用c。能够透过细胞膜有些细菌对多种代谢类似物不敏感，可以通过改变培养条件提高其敏感性2) 营养缺陷型的筛选和回复突变首先诱变选育目标产物的营养缺陷型菌种 然后以营养缺陷型为出发菌株诱变并选育回复突变株有些回复突变子具备抗反馈抑制和反馈阻遏的能力改变细胞的通透性1) 增强细胞的通透性可以使代谢产物分泌到发酵液中，具有如下的作用：有利于代谢产物的后提取避免代谢产物在胞内大量

13、积累而产生的抑制或阻遏作用避免代谢产物在胞内大量积累而产生的细胞毒性eg。谷氨酸的发酵生产用青霉素(penicillin)调节细胞的通透性青霉素是一种常用的抗生素，其作用机理是抑制细菌细胞壁的合成在对数生长期内加入青霉素能启动谷氨酸的分泌，使细胞内的谷氨酸的含量迅速下降到5mg/gDCW而不改变细胞的代谢活性控制生物素(biotin)的添加量调节细胞的通透性生物素是细菌脂肪酸合成中的重要辅酶，生物素缺乏可以改变细胞外壳的脂质成分，使细胞的通透性发生变化3 次级代谢产物的生物合成与调节微生物次级代谢产物的概念次级代谢产物 ( secondary metabolites)又称次生代谢产物或分化代谢

14、物，是由微生物在生长后期产生的，为菌体生长非必须但对产生菌的生存具有一定价值的，分子结构相对复杂的小分子化合物。小分子化合物在菌体生长后期产生对微生物的生长代谢无贡献常为数种结构极相似的化合物群体其生物合成常与微生物的分化过程同步1) . 次级代谢产物合成与初级代谢的关系 次级代谢产物合成所需要的前体由初级代谢产物提供 次级代谢产物合成所需要的能量由初级代谢过程提供 次级代谢产物的合成一般受碳、氮分解代谢物的阻遏由初级代谢产物衍生次级代谢产物的途径主要有以下几种:葡萄糖碳架(carbon skeleton)掺入途径莽草酸 (shikimate)途径与核苷 (nucleotide)有关的途径聚酮

15、体 (polyketide)和聚丙酸途径由氨基酸 (amino acid)衍生的途径甲羟戊酸 (mevalonate) 途径其他复合途径2) . 次级代谢产物生物合成的调节方式酶的诱导有些次级代谢产物合成的关键酶( key enzymes) 受分解代谢产物的阻遏，同时，有些酶还受一些化合物( 前体 ) 的诱导色氨酸对生物碱合成酶的诱导作用蛋氨酸对头孢菌素合成酶的诱导作用甘露聚糖对链霉素合成中.z-D- 甘露糖酶的诱导反馈调节青霉素的生物合成受赖氨酸的反馈抑制芳香族氨基酸反馈抑制杀假丝菌素的生物合成麦角生物碱的生物合成途径中二甲烯丙基转移酶受麦角碱的反馈抑制芳香族氨基酸为杀假丝菌素生物合成途径的

16、分枝途径的终点产物，对早期共同途径的一个酶具有反馈调节作用分解代谢物的调节能荷调节四环素、金霉素等的生物合成受能荷的调节-胞内ATP含量高时抑制四环素和金霉素的生物合成能荷受培养基中的磷酸盐含量、底物浓度等因素的影响4 酶生产的调节调节酶合成效率的主要因素诱导作用 ( 酶的诱导 )微生物细胞内酶的合成通常要受到阻遏作用，需要加入诱导剂才能使酶能够过量积累。组成型突变 ( constitutive mutation)：在含基质诱导物限制浓度下培养产生菌。用非诱导型基质培养产生菌，如用2- 硝基苯 -:-1 -阿拉伯糖为底物可以获得阻成型的半乳糖苷酶的产生菌。诱导物的类型：酶催化的底物(基质 )

17、、底物的结构类似物、产物、辅酶反馈阻遏酶催化反应的产物的阻遏作用氨基酸对蛋白酶的阻遏作用葡萄糖对淀粉酶或纤维素酶的阻遏作用磷酸盐对核酸酶或碱性磷酸酯酶的阻遏作用酶催化的代谢途径中终点产物的反馈阻遏铵根离子对蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶的阻遏作用。解除酶生产过程中代谢终点产物阻遏作用的方法加入某种代谢途径的抑制剂，限制终点产物的积累在线分离某种代谢途径的终点产物，如NH4+ 等 筛选抗代谢终点产物类似物的突变株筛选某种代谢终点产物的营养缺陷型突变株分解代谢物阻遏作用二次生长现象（ diauxie ）分解代谢物阻遏作用的定义：当微生物在含快速利用的碳源（如葡萄糖）的培养基中生长时，会在转录的水平上抑制

18、多种酶的合成。原因：降低细胞内 CAMP的含量，使腺苷酸受体蛋白（CRP） 的活性降低，从而降低合成这种酶的基因的转录活性分解代谢物与无活性的阻遏蛋白结合，使之变为具有活性的阻遏蛋白，降低基因的转录活性。基因剂量提高酶合成效率的方法 提高酶合成效率主要有两种方法 提高单基因的转录和翻译效率，如添加诱导物、解除反馈阻遏作用、解除分解代谢物阻遏作用等 提高细胞内该酶基因的剂量：通过基因工程的手段进行5 生产菌种的种类、来源和选育自然选育诱变选育杂交育种分子育种1）自然选育的概念、原理、步骤和特点概念：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变（ spontaneous mutation ）

19、而进行菌种筛选的过程称为自然选育。步骤：特点：关键是要获得纯的菌落 对于细菌，可以在新鲜肉汤中培养，避免细胞粘连在一起。 对于放线菌和霉菌的孢子，则可采用玻璃株和石英砂打散后用滤纸或棉花过滤。2）诱变育种的概念、步骤、特点和应注意的问题概念：利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快捷和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株的过程。步骤：选择出发菌株制备菌悬液诱变剂量的选择诱变剂量的选择复合诱变剂初筛根据菌落的形态变化筛选 根据特定产物的合成机理或菌种特性筛选，即所谓的理性化筛选。如筛选抗代谢类似物突变株、筛选营养缺陷 型突变株、筛选抗生

20、素的抗性菌株等复筛 用与生产条件相似的培养基培养突变株，对突变株的生产能力进行验证。3）几种典型的诱变剂及其作用原理紫外线氮芥亚硝酸4）杂交育种放线菌的杂交原理霉菌的杂交原理5）原生质体融合原生质体以及原生质体融合的概念所谓原生质体融合（protoplast fusion） 就是在高渗的条件下把两个亲本的细胞通过酶解瓦解，得到原生质体，并在助融合剂如 PEG 的作用下使两个亲本的原生质体发生融合的过程。原生质体：在高渗溶液中出去细胞壁的细胞。6 培养基1）碳源定义以及常用碳源的名称如葡萄糖、淀粉、乳糖等定义： “碳的来源”，是指经微生物吸收转化后可以提供菌体碳元素的营养物质2）氮源定义以及常用

21、氮源的名称如蛋白胨、黄豆饼粉、玉米浆、酵母抽提物等定义： “氮的来源”，是指被微生物吸收转化后可以提供组成菌体的氮元素的营养物质。3）碳氮比定义以及通常使用的范围碳氮比：培养基中元素C和元素 N的比值，有时也以培养基中总糖含量与粗蛋白总含量的比值来表示。一般工业发酵培养基的碳氮比为100： 0.5-2.0碳氮比适中时有利于菌体生长，碳氮比过高或过低使有利于代谢产物的积累。如谷氨酸发酵中100:15-214）培养基中不同碳源的搭配5）培养基中不同氮源的搭配快速利用氮源与缓慢利用氮源的搭配快速利用氮源：无机铵盐、氨基酸缓慢利用氮源：一些有机氮源如鱼粉、黄豆饼粉等。6） 前体定义以及青霉素、红霉素等

22、生物合成中使用的前体前体 （precursor）:直接或经转化后可以作为次级代谢产物的结构单元整合到次级代谢产物中，并促进次级代谢产物合成的小分子化合物。7）孢子培养基、种子培养基和发酵培养基的用途和配制要点按用途分：斜面培养基（ 孢子培养基）主要用于菌种的固体培养工业上也常用大米、小米培养基来培养孢子（主要用于培养霉菌的孢子）种子培养基用于发酵用种子的扩大培养营养应完全、丰富可以使菌体迅速生长最后一级种子培养基的成分应尽量接近发酵培养基发酵培养基菌体生长和产物合成兼顾有时需要加入产物合成所需的特定元素、前体和代谢调节剂可以采用补料方式分批加入培养基7微生物反应器（ 发酵罐）1）发酵罐的分类按

23、能量的输入方式，发酵罐可以分为以下几类内部机械搅拌型发酵罐（通用式发酵罐？）外部液体循环式发酵罐空气喷射提升式发酵罐2）通用式发酵罐尺寸主要部件及其功能主要部件（功能没有讲清楚？）a、 罐体容器密封、隔离高径比 1.7-3b、 搅拌桨搅拌、使发酵液混合均匀打碎空气气泡、增加气液接触界面、加强气液传质使发酵液中的固性物料或菌体处于悬浮状态搅拌产生两种流态：径向液流和轴向翻动搅拌桨的类型平叶型弯叶型箭叶型c、 挡板全挡板条件：在发酵罐中加入合适的挡板使发酵罐在搅拌的状态下完全不产生旋涡。d、 消沫桨 ：耙式消沫桨涡轮式消沫器e、 温度控制装置：蛇管和夹套f 、 空气分布器- 环型、置于罐底g、 视

24、镜h、 管道与阀门进气与排气放料管道蒸汽管道取样阀补料管道i 、电极 （probe ），包括温度、溶氧和pH 电极8 种子的扩大培养1）实验室种子的制备工艺工艺要点对于产孢子能力强的菌种，用扁瓶（茄子瓶）培养孢子，eg、茄子瓶：用于较大规模培养细菌或孢子的扁平的玻璃瓶对于细菌或酵母可用茄子瓶制备斜面对于厌氧菌可用三角瓶制备种子对于产孢子能力弱或不产孢子的丝状微生物（包括链霉菌和丝状真菌 ），用三角瓶制备液体种子2）生产车间种子的制备工艺种子罐级数的确定：菌种的生长性能发酵罐的容积其它一些特殊的因素，如阿维菌素的发酵只能采用二级发酵，用三级发酵时发酵水平低二级发酵三级发酵四级发酵接种龄（又称为菌

25、龄或种龄 ）：在种子罐中培养微生物的时间，一般是指从培养开始到移入下一级种子罐或发酵罐的培养时间接种量：接入种子液的体积与接种后培养液总体积的比例，通常以百分数表示3）发酵种子应满足的要求4）控制种子质量的措施9 发酵过程控制1）发酵过程的代谢变化规律基本概念：概念从书上找菌体浓度 （X, g/L ） :底物浓度 （S, g/L ） :产物浓度 （P, g/L ）:菌体对底物的得率因子 （YX/S）:菌体的生长速率和比生长速率生长速率 （rX ）: 单位时间内菌体浓度的增加量比生长速率 （?）：单位时间内单位菌体量所产生的菌体增加量OUR， CER 和 RQRQ 为 CO2 的生成速率与O2

26、消耗速率的比值OURCER底物消耗速率和比底物消耗速率产物生产速率和比产物生产速率2）分批发酵的代谢变化规律引起分批发酵后期菌体生长速度下降的原因底物消耗抑制性（inhibitive） 代谢产物的积累微生物细胞之间的信号传递（quorum sensing ） 控制微生物群体的数量产物合成的类型以及各自特点生长关联 （耦联）型产物的合成速率与菌体比生长速率成正比非生长关联 （耦联）型产物的合成速率与菌体的量成正比3）补料分批发酵补料分批发酵的优点 避免底物抑制 避免积累代谢副产物，提高发酵效率 消除快速利用碳源的分解代谢阻遏作用 避免有害代谢产物的积累连续发酵定义:以恒定的速度连续加入新鲜培养基

27、到发酵罐，并以相同的速度放出含有产品的发酵液连续发酵的特点：通过调节培养基中底物浓度和流速，可以较方便地调节培养基中菌体浓度、底物浓度和产物浓度物浓度在较低的水平上可以得到较高的菌体浓度和产物浓度，提高设备利用率能维持培养基中底5）温度对发酵的影响发酵热的概念及其组成部分发酵热的概念发酵过程中释放出来的净热量温度影响微生物发酵的途径（温度对代谢产物合成的影响？）通过调节酶反应速度调节代谢产物的合成改变发酵液的物理、化学性质间接影响代谢产物的生物合成 影响生物合成的方向金色链霉菌30C 合成金霉素，在35C 合成四环素最适温度的选择恒温发酵：初级代谢产物菌体生长的最适温度与产物合成的最适温度差别

28、小变温发酵：菌体生长的最适温度与产物合成的最适温度差别大通常在次级代谢产物的发酵中应用6）DO 对发酵的影响和控制DO 的表示方法：氧气饱和度的百分数临界氧浓度： 临界氧浓度是指不显著影响微生物生长或代谢产物合成的最低氧浓度。 临界氧浓度时，当发酵液中的溶解氧浓度低于菌体生长或产物的合成受到显著影响 控制发酵液中溶解氧浓度的目的和方法目的：尽量使溶解氧浓度高于临界氧浓度方法：提高搅拌转速提高通气量用纯氧代替空气或采用富氧空气进行通气降低温度控制底物浓度增加罐压采用对溶解氧要求不高的菌种根据溶解氧浓度判断异常发酵的情况发酵液中污染好气性杂菌污染噬菌体发酸现象设备故障或操作事故引起的异常发酵：搅拌故障、补料速度过快、通气异常引起发酵液pH 变化的因素以及发酵过程中pH 变化的一般规律引起发酵液pH 值下降的因素：菌体快速利用碳源菌体利用生理酸性盐菌体利用油脂引起发酵液a、菌体快速利用氮源b