革兰氏染色的机理和步骤

1、1.革兰氏染色的机理和步骤机理：G+、G-主要由其 CW 化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。G+的 CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。乙醇脱色时CW 脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。G-的 CW：肽聚糖层薄，脂质含量高。 乙醇脱色时， 类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。步骤：涂片：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。固定：将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。初染：用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。媒染 : 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。 (细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作

2、用）脱色 (关键步骤）：以 95%的乙醇脱色 30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。水洗，吸干。复染： ?(第 2 张）复染 30s，水洗吸干。干燥镜检。2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高， 这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。3、引起微生物培养过程中PH 变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培 PH 稳定。答：培养过程中，由于营养物质被分解利用， 代谢产物的形成与积累，会导致 PH 变化。（第 2 张中的图）还

3、与培养基的 C/N 比有关， C/N 高，经培养基后PH 显著下降， C/N低，经培养基后 PH 明显上升。PH 调节： 加入缓冲剂 -常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH 范围内调节（ 6.4-7.2）大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的 PH 过度增加，但可不断中和微生物产的酸。培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽， Pr 均属两性电解质，也起缓冲的作用。过酸：治标 -加 NaOH、Na2CO3中和，治本 -加适量氮源：NaNO3、Pr、NH3H2O；增加通风量。过碱：治标 -H2SO4、HCl 中和，治本 -加适

4、量碳源 :G 类，脂类;减小通风量。3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？抗生素法（青霉素法） ：适用于细菌。原理：青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型 B 处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B 在基本培养基上休眠状态存活下来，从而达到浓缩营缺型目的。制霉菌素法适用于真菌，其可与 cm 上？（第 1 张）醇作用，引起cm 损伤，因为它只能杀死生长繁殖着的真菌，所以 . 菌丝过滤法 :基本培上，野生型霉菌，？菌的孢子能萌发并长成菌丝，而缺型孢子一般不萌发，或不能长成菌丝，因此培养一段时间后，用灭菌脱脂棉或滤纸滤去菌丝， 收集滤液，重复数遍后

5、可除去大部分野生型，从而 ,4、生产蛋白酶的枯草芽孢杆菌发生遗传变异，使得产量性状下降，你如何解决？写出具体实验方案。答：将一定量的枯草芽孢杆菌培养液，做一定浓度的稀释，涂布在含有酪素蛋白质的基本培养基上， 37C 培养一段时间后，取出培养基，观察单菌落形成的透明圈大小， 取透明圈直径与菌落直径之比较大的菌落，挑取培养做进一步的鉴定， 即可得到高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌。5、以磺胺为例，说明化学治疗机的作用机制。答：机理:磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，（磺胺类药物取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢紊乱，从而抑制B 生长） ，磺胺的抑菌作用是因为许多细菌需要

6、自己合成叶酸而生长， 磺胺对人体细胞无毒性， 因为人体缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的相关酶-二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行合成叶酸， 而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。 （磺胺类 -与正常代谢产物竞争酶的活性中心，干扰了酶的功能，从而干扰代谢的正常进行） 。6、画出生长曲线。（第 1 张）1、微生物的共性？哪个最基本? 答：体积小，面积大（最基本）吸收多，转化快生长旺，繁殖快思适应性强，易变异分布广，种类多。2、比较 G+，G- B 在 CW 结构，组成，对溶菌酶，青霉素的敏感性4 方面的异同点。结构成分对溶菌酶青霉素G+ 单层， 组分简单，厚肽聚糖（ 90%）磷壁酸（ 1

7、0%）敏感生 长 期 的G+对其敏感G- 多层， 组分复杂，薄内壁层：肽聚糖外膜：脂多糖，磷脂，脂蛋白敏感不敏感3、表型延迟现象？如何克服？答：表型延迟：表型的改变落后于？（第四张）改变的现象，分为分离性延迟 ;突变的？经 DNA 复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。生理性延迟;杂合状态纯合状态，仍不能表现出来， （如营缺型）通过中间培养（CM，培养过夜），可使突变？稳定下来，克服表型延迟。4、培养 B 常用的斜面培养基是什么？简述配制程序。答：牛肉膏蛋白胨培养基称量 ;按配方依次准确称量融化:取少量水于烧杯中，加 1%的蛋白胨，加热溶解，加0.5%的牛肉膏，加热溶解，加0.5%的

8、 NaCl,热熔，加水补充到所需体积。 调 PH 至 7.6左右。加琼脂固体 2%， 热熔。分装入试管，加塞，包扎，高压灭菌搁置斜面（斜面长度不超过试管一半）无菌检查：将灭菌的培养基放入37C 的温室中培养24-28h，以检查灭菌是否彻底。5、啤酒酵母在分批发酵中的生长曲线分哪几个时期？在菌种扩培时，哪个时期做种子？为什么？答：延滞期，对数生长期，稳定期，衰退期。对数期做种子。利于缩短延滞期。6、菌种衰退的根本原因？防治措施？答：？的自发突变。措施：减少传代次数创造良好的培养条件采用不易衰退的菌种传代采取良好的菌种保藏措施4、菌种衰退的根本原因，防止措施。如何区分衰退和饰变？答：根本原因：？的

9、自发突变。 （传代次数的影响，是负突变株比例占优势，培养条件）防止措施见上题。区分：衰退：指随着菌体的不断生长，负突变菌株的数量占整个菌体数量的比例增大，最终导致菌株的生产性能大幅下降的现象。原有形态性状不典型， 生长速率下降代谢产物生产力下降对宿主侵袭力下降抵抗力下降饰变:遗传物质结构不发生变化，而只在转录与转译水平上的表型变化，可以同一条件继续培养，观察子代的情况。饰变特点：暂时性，不可遗传性，表现为全部个体的行为。变异：遗传性，群体中极少数个体的行为。5、gone？突变的特点？答：自发性非对应性稀有性（突变率10-610-9）独立性可诱发性（升高 10105 倍）稳定性可逆性 （原养型

10、突变型）6、v（第三张）的特点。答：形体微小，能通过细胞滤器（0.22um） ，电子显微镜下才能看见不具有细胞机构，主要成分NA，PrV 只含有一种核酸， DNA或 RNA无核糖体，即无产能酶系，也无Pr,NA 合成酶系，专性活细胞内寄生无个体生长，也不进行二分裂，以NA,Pr 等“元件”装配，实现大量繁殖。 离体下以无生命的生物大分子状态存在对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。7、？月元病毒的致病机理。答：月元病毒是一种Pr 侵染颗粒，仅有 Pr 组成，称作 PrP。细 胞 型 PrP-PrPc 对 蛋 白 酶 敏 感 ， 无 凝聚 能 力 ， 而 致 病 型PrP-PrPsc对蛋白酶有一定

11、抗性，可凝集成纤维状组织，PrPsc 进入细胞后， 与 PrPc结合，形成 PrPsc-PrPc复合体，PrPc构型发生改变，转化成 PrPsc，PrPsc数量呈指数增加，其潜伏期长，对中枢神经损害严重。估菌计数法及其特点（笔记P31）乳糖操纵子（ P30）1、营养价值融化温度（） 凝固温度（）常用 C(%) 琼脂无96 40 1.52.0 明胶氮源35 20 512 2、伴孢晶体？它在何种B 中产生？答： 伴孢晶体：苏云金芽孢杆菌等少数芽孢杆菌在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体（肉毒素）称为伴孢晶体。对约 200种昆虫无为鳞翅目幼虫有毒杀作用，可制成B 杀虫剂

12、。3、霉菌菌落的特征？答：质地疏松，呈絮状，网状，绒毛状，地毯状。形态大，分为局限性生长（青、曲）和蔓延性生长（根毛）菌落干燥（孢子）颜色丰富，正反颜色常不一致， 中心与边缘常不一致。 各种霉菌，在一定培养基上，形成的菌落大小，形状，颜色相对稳定，为分类依据之一。4、利用磷酸盐或碳酸钙如何维持PH 稳定性？答：磷酸氢二钾略呈碱性，磷酸氢二钾略呈酸性，两物质以等摩尔浓度溶液 PH 为 6.8，其缓冲能力一般在6.47.2范围内有效。磷酸氢二钾 +H 阳离子 -磷酸氢二钾 +K 阳离子磷酸二氢钾 +K 阳离子 +OH- 磷酸氢二钾 +H2O 大量产酸的菌株，加入碳酸钙调节，碳酸钙难溶于水，不会使培

13、养基 PH 过度升高，但可不断中和微生物产的酸，同时放出二氧化碳，而降培养基 PH 控制在一定范围。5、单倍体酵母细胞经 ?（第 5 张）诱变后，得到一系列的突变株，欲从中分离筛选出一株（Leu-),请设计合理的试验程序。答：淘汰型野生型（制霉菌素法）检出鉴定（滤纸片法）将单倍体酵母细胞突变株，制成菌悬液，均匀涂布于完全培养基上，长成单个菌落之后， 以逐个检出的方式接种于完全培养基上，并影印到基本培养基上，在适宜条件下培养一段时间， 在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的， 即为营养缺陷型菌株。 将此菌株检出离心，水洗之后制成适当浓度的菌悬液，与基本培养基均匀混合后，倾注于平板中，干燥凝

14、固之后，在板上划分几个区，在区中加入蘸有色AA 的滤纸片，经培养后，在纸片周围有浑浊的生长圈的，说明为色AA 营养缺陷株。6、MR,V.P.实验的原理。答：MR：用来检测由 G 产生的有机酸，如甲酸，乙酸，乳酸等，细菌代谢糖产酸， PH 降低，甲基红指示剂由橙色（PH=6.3）变成红色（PH=4.2）大肠杆菌 -阳性：利用乳糖产生乳酸，培养后PH4.5 大肠杆菌 -阴性：早起产有机酸，后转化有机酸乙醇，丙酮酸。V.P. 用来测定细菌利用G 产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸经缩合乙酰甲基甲醇（经碱性、氧化）二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精AA 中胍基作用， 生成红色化合物， 产气肠杆菌

15、-阳性，大肠杆菌 -阴性。7、什么叫生长曲线？单细胞微生物的典型生长曲线分几期？划分依据？答： 生长曲线：将少量纯种单细胞微生物接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量， 以培养时间为横坐标， 以菌数的对数为纵坐标作图，得到一条反应在整个培养期间菌数变化规律的曲线。分为延滞期，对数期，稳定期，衰亡期。根据生长速率常数划分，即单位时间内分裂次数的不同。8、为什么诱变时，要制成充分分散的单细胞或单孢子悬液？对放线菌进行诱变育种时，宜处理其孢子还是菌丝细胞？为什么？答：使每个细胞均匀接触诱变剂，减少表型延迟现象，并避免长出不纯菌落。多使用单核无性孢子，由于孢子生理上处于休眠状态，单核区基中了大

16、部分的DNA，减少分离表型延迟，提高突变效果。培养基原则：目的明确适宜的营养物质浓度及配比合适控制PH 条件控制氧化还原电位原料来源经济节约灭菌处理1、青霉素的作用机制？答 ： 原 理： -内 酰胺 环 的 结 构与 肽 聚 糖 单体 五 肽 尾 末端 的D-Ala-D-Ala 二肽结构相近，因而可竞争性的抑制转肽酶的活性，抑制单体间交联，形成缺损的CW。青霉素对生长旺盛的G+有明显的抑制作用，对休眠期的无抑制，对G+的作用比 G-强得多。2、筛选抗代谢结构类似物突变株的意义是什么？答：在含有较高浓度终代谢结构类似物的培养基中，野生型细胞不能生长，而遗传性的解除了反馈抑制或反馈阻遇的抗代谢结构

17、类似物突变株则能生长，突变株在终产物累积的情况下仍然可以不断合成这一产物，所以采取一定的方法，筛选到抗代谢结构类似物突变株，即可获得终产物的高产菌株。3、酿酒酵母生活史。（同 P15) 4、烈性噬菌体？生活史包括几个过程？答：感染宿主细胞后能在细胞内正常复制并引起宿主细胞迅速裂解的噬菌体。吸附侵入增殖（ NA 复制，Pr 的生物合成）装配（成熟）裂解（释放）5、缩短延滞期的措施答：利用遗传学方法改变种的遗传特性，使延滞期缩短，利用对数生长期的细胞做种子， 尽量使接种前后使用的培养基组成不要相差太大适当扩大接种量6、计算代时 (G） ，繁殖代数（ n） ，生长速率常数（ R）答：见第七张7、诱变

18、育种？举例非电离辐射诱变剂电离辐射诱变剂烷化剂插入诱变剂间接引起碱基置换的诱变剂答：诱变育种： 指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后从中选取少数符合育种目的的突变株的方法。紫外线 x 射线，射线 EMS，NTG吖啶类颜料， ICR 类碱基类似物 (5-BU 等) （直接引起：亚硝酸G:CA:T,羟胺 :只引起 G:CA:T 烷化剂 G:CA:T ）8、什么是鉴别培养基？利用EMB 培养正常大肠杆菌和沙门氏菌时，菌落现象？为什么？答;鉴别培养基：用于鉴别不同类型微生物的培养基，在培养集中加入能与目的菌的无色代谢产物发生颜色反应的指示剂，从而用肉眼就能将该种微生物的

19、菌落与外形相似的其他微生物菌落相区分的培养基。伊红和美蓝在低酸度时结合形成沉淀，起产酸指示剂作用， 大肠杆菌强烈分解乳糖而产生大量混合酸，菌落被染成深紫色， 还可看到绿色金属闪光。沙门氏菌不能利用乳糖，菌落无色通明。1、微生物的产能方式有？与食品发酵工业密切相关的微生物的代谢方式有哪几种？答：微生物产能方式分为：发酵，有氧呼吸，无氧呼吸。与食品发酵工业密切相关的发酵，实质是底物水平磷酸化，底物氧化不彻底，产能水平低，为厌氧条件，兼性厌氧菌在有氧的条件下，从发酵呼吸作用，对发酵作用抑制（巴氏效应）2、高压蒸汽灭菌法的操作步骤和注意事项？答：步骤：取出内层锅，外层锅加水至与三角搁架相平放回内层锅，

20、放入带灭菌物品， 加盖并将盖上排气软管插入内层锅打开加热开关， 并同时打开排气阀3-5Min关上排气阀，温度升至 121计时，控制热源 119-123 15-20min关上开关，断电后压力降 0 开盖取物无菌检查注意；切勿忘记加水，水量不可过少三角瓶，试管口不要与桶壁接触切勿忘记打开排气阀排锅内空气压力降为0 才能打开排气阀，开盖3、培养基应包括哪几种营养物质？如何控制PH？答；碳源，氮源，能源，生长因子，无机盐，水治标过酸-NaOH、NH3H2O,过碱-H2SO4、HCl 治本酸-加氮源，增大通风量，碱-加碱？（第 8 张）源，减小通风量加缓冲剂：加碳酸钙4、如何延长对数生长期？答;补充营养

21、物质，调整PH，取走代谢产物，改善物化条件，调整营养配比， C/N 比 4/1 时，菌体大量繁殖。5、简述烈性噬菌体一步生长曲线制作过程，并绘制曲线图。答:适量噬菌体接种于培养好的高浓度敏感细胞中，经数min 吸附后，将培养物高倍稀释，或加入抗V 抗血清，中和给定时间内未吸附的噬菌体，从而使因吸附噬菌体建立同步感染适温下继续培养，定时取样，测样品中V 的效价。感染T 横坐标， V 效价纵坐标，绘制定量描述烈性噬菌体生长规律的试验曲线。（曲线见第 9 张）6、利用物理化学诱变剂对微生物进行诱变的目的有哪些？中间培养的目的？用简图表示利用EMS 对微生物进行诱变育种的过程？答：诱变育种目的： 获得

22、高产菌株抗性突变种营养缺陷型突变株（检致癌物，高产次代产物）中间培养为了克服表型延迟现象。EMS（甲基磺酸乙酯） -烷化剂-直接引起碱基置换（烷化后的碱基引起碱基配对错误，也能使嘌呤整体直接从DNA 链上脱下来，产生一个缺口， 在与缺口相对应的位点上，就能配上任何碱基，从而引起转换或颠换）选择出发菌株前培养，制作菌悬液EMS 合适剂量诱变处理中间培养初筛培养基涂布划线分离菌种鉴定7、简图表示两亲株细胞 （A+B-、A-B+）进行原生质体融合的操作示意图，并对主要步骤作简要说明。答：见第 9 张常用培养基：细菌 -牛肉膏蛋白胨培养基（ PH7-7.5）放线菌 -高氏 1 号培养基（ PH7-7.5）酵母菌 -麦芽汁培养基（PH4.5-5,5）霉菌 -查氏合成培养基（ PH4.5-5,5）1、放线菌的培养： 28，3-5d，PH=77.5 染色：碳酸复红染 1min 观察： （链霉菌）菌落干燥紧密，正反颜色不一致，边缘有辐射状皱褶，小不蔓延，不易挑起。2、酵母菌培养： 2528，24h，PH=4.55.5，染色：美蓝 -活体染色观察： （酿酒酵