鸡柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定研究

1、鸡柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定研究作者 曹元元，郭维维，龚加路，刘林帅，杨乐乐，张乐乐 指导教师葛凯摘要：取具有球虫病典型症状的病鸡，刮取其肓肠内容物，川离心沉浮法收集鸡球虫卵愛, 加入适量的2. 5%重锯酸钾溶液，置于29°c±rc的恒温培养箱中培养，定时观察卵囊的发育 情况，并测量卵囊的人小，结合病鸡的临床症状和病理变化，计算卵形人小等形态指标，经 差异显著性检验(f检验)，结杲差异不显著，而冃观察病鸡病理变化，初步鉴定分离到的鸡 球虫为柔嫩艾美耳球虫。关键词：鸡，柔嫩艾美耳球虫，分离，鉴定the isolation and identiflcation of eime

2、ria tenella inchickenabstract: take a typical symptom of coccidiosis in chickens, scraping the cecal contents, were collected by centrifugation ups and downs of chicken coccidia oocysts, adding an appropriate amount of 2.5% potassium dichromate solution, placed in 29 c ± 1 °c in the consta

3、nt temperature incubator, regular observation of the development of oocysts, and to measure the size of oocysts, with chickens in the clinical symptoms and pathological changes in laboratory measurements obtained from chickens infected with oocysts body size, egg size calculation form indicators, th

4、e significant difference test (f test), the result was not significant, and the observed pathological changes in chickens, isolated from the chicken identified as eimeria tenella.key words: chicken, eimeria tenella. isolation, identification鸡球虫分布范围广，危害人，严重威胁养禽业的发展，每年给全世界养禽业 造成超过20亿英镑的直接经济损失，我国在这方面虽无

5、准确的统计，但由于鸡 只饲养规模人、数量多，加z管理粗放，鸡球虫病造成的经济损失相当惊人， 因此，许多学者致力于球虫病的研究。集约化养鸡场是球虫病暴发的最适宜场所, 其发病率可高达80%以上。鸡球虫病的病原为原虫中的艾美耳科艾美耳属的球 虫。鸡球虫病(coccidiosis)是由多种艾美耳球虫寄生于鸡的肠上皮细胞引起的 一种原虫病。木病分布广泛，感染普遍，是鸡群中最常见的，也是危害最严重的寄 生虫传染病。据报道，界各国已经记载的鸡球虫种类共有13种之多，我国已 发现7种鸡球虫，不同种的球虫，在鸡肠道内寄生部位不一样，其致病力也不相 同。其屮致病力最强的为柔嫩艾美耳球虫eimeria tenel

6、la）,寄生于盲肠，其次 为毒害艾美耳球虫e.necatrix） o在fl然发病情况下，多系混合感染，而以某一 种占优势。为了研究的方便及研究结果的准确性，往往应用纯种。应用单卵囊 分离技术，可进行鉴别球虫的种类和建立球虫的纯种体系。尽管冃前分子生物 学技术等一些高科技手段已用于鸡球虫种类鉴定方面的研究，但传统的形态学鉴 定方法仍然是不可缺少，并且是可靠的。皖西地区的养鸡业趋于集约化和规模化, 鸡球虫病的仍普遍发生。为此我们对皖西地区鸡球虫的利啖进行初步鉴定，对进 一步研究球虫的致病性，药物效应和机体对球虫的免疫性等均有重要的意义。1材料与方法1. 1实验材料六安市附近某养鸡场提供一只典型球虫

7、病鸡。1. 2试剂和仪器2. 5%重銘酸钾溶液、饱和食盐水溶液、生理盐水、吸管、40忖铜丝筛、260 廿尼龙筛、研钵、平皿、双h生物显微镜（型号:xs-200,江南光电集团）、低速 离心机（型号：800,江苏天出有限公司）、电热恒温培养箱等。1.3卵囊的分离与培养取病鸡盲肠，刮取其内容物和黏膜，研碎后加生理盐水搅匀，经40日铜丝筛 和260目尼龙筛过滤，滤液2000r/min,离心lomin,收集沉淀。沉淀置2. 5%重珞 酸钾溶液中，在29°c恒温培养箱内培养成熟，然后将成熟的卵囊液置4£冰箱屮 保存备用。1. 4球虫卵囊的接种1.4.1显微镜镜检球虫卵囊数取冰箱中在4&

8、#176;c保存的孑包子化卵囊悬液，2000r/min, lomin,弃上清，同上 速度和时间离心34次，洗去重馅酸钾;加饱和食盐水漂浮，吸取上层漂浮液于另 一离心管中，加人人量生理盐水离心沉淀，弃上清，再加生理盐水离心（速度和 时间同上）,然后将最终沉淀（卵囊悬液）做倍比稀释。用牙签沾取稀释后的卵囊液，点在载玻片上，显微镜下观察，利用血球记数 板记数，观察卵囊中子抱子的成熟程度，卵囊屮有4个子抱子形成，说明此球虫 已经具有感染性。1. 5虫种鉴定观察1.4.1中获得卵囊形状、颜色、人小等特征，记录最短抱子化时间，并分 别随机测量50个抱子化卵囊，抱子囊人小，并将测量数据进行差界显著性检验(f

9、 检验)。参阅有关文献进行虫种鉴定®铁2结果与分析2.1分离和经培养后的球虫卵囊如图1和图2所示。图1：未抱/化的球虫卵囊图2：砲子化的球虫卵囊26球虫种类的鉴定显微镜下观察未孑包子化卵囊，多呈宽卵圆形，少数卵圆形，壁光滑，呈淡绿 色，原生质呈淡褐色，卵囊最短抱子化时间为18h；抱子化卵囊，未见卵膜孔和 卵囊残体。随机测量50个两代他子化卵囊和抱子囊人小，数据见表1。表1卵囊的测量结果卵囊大小(lim)平均(pm)他子囊大小(m1)平均(pm)19. 5026. 00 x资料一22.00x 19.0016.50-22. 80资料二16. 0027. 00 x21.00x16.500.

10、 0013.00x12.20x6. 0015. 0024. 004. 50-7. 50资料三k17. 5030. 00 x21.80x17.2910.00-13. 00 x11.49x6. 3512. 5025. 005. 00-7. 50资料四15. 0025. 00 x20. 16x15.5910.0012. 50 x11.64x5. 8612.50*18. 754. 38*6. 88第一代18. 98x20.2411.51x5. 9917.71-22. 774. 40-7. 25通过和文献3、4、6、8比较，本次实验测得的卵囊大小在文献记载 范围之内。综上所述，我们从卵囊的形态、大小、颜

11、色等一系列特征出发，结合本次病 理变化等结果，可以认为本次从养鸡场鸡体内分离的球虫是柔嫩艾美耳球虫。 3讨论3.1形态学方法在柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定中的应用传统的形态学方法在球虫的分离与鉴定屮准确性高，对虫种的鉴定具有可 靠性。据资料报道，我国公认存在的9种鸡球虫，其卵囊只有大小的差别，其 它方面区别不明显，如形态、构造、颜色等不易区别，而且它们均无卵膜孔和极 帽等，因此仅仅根据粪便中卵囊的上述特征来鉴定虫种是比较困难的。但是不同 种球虫主要寄生部位是不同的，收集新鲜的卵囊，待培养形成砲子化卵囊后，观 察卵囊的人小、形状、颜色，解剖发病鸡，并结合感染鸡的病变和球虫寄生部位 进行鉴定，这种鉴

12、定方法是球虫种类鉴定中行之有效的方法®役3.2柔嫩艾美耳球虫显著的特征是寄生于盲肠和临床上出现明显的血便，我们 分离获得的这株球虫具有此特征，其卵囊结构、测得的卵囊和也了囊大小、形状 和砲子发育最早时间均在文献记录的范围。因此，可鉴定这株纯种球虫为柔嫩艾 美耳球虫。3.3柔嫩艾美耳球虫的致病性在不同地方株z间有明显差异木次分离获得的纯种柔嫩艾美耳球虫，是鸡场最常见的球虫种类之一，致病 力强，严重感染时造成鸡的死亡率较高，本试验感染的鸡仔有明显的病理变化。 因此，本次分离获得的柔嫩艾美耳球虫可作为实验室强毒标准株，为免疫研究中 提供攻毒虫体和球虫致弱的原代虫体具有重要意义。与其他地方球

13、虫株进行比较 71,木次所分离岀来的球虫为典型的柔嫩艾美耳球虫，寄生于鸡肠道部分的盲肠 部位，对盲肠有很人的侵害作用。3.4柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定的一些相关的先进技术chapman等对球虫单卵囊技术进行过研究和报道。国内学者田广孚问等曾 用8cm高的deae52纤维素柱，以ph为& 0的甘氨酸缓冲液作为洗涤液对柔嫩艾美 耳球虫进行了提纯。但因需要特殊仪器，操作技术繁杂，一般设备条件下根木无法办到。在生物化学方法上，用胃蛋白酶消化有肠道组织，铜筛过滤除去大颗粒 杂质后，以1. imol/ml蔗糖离心漂浮卵囊，然后用小于0. 5mol/ml蔗糖溶液反复 漂洗，最后以5%次氯酸钠消毒处理

14、，获得了大量纯化柔嫩艾美耳球虫卵囊刖。忖前球虫研究已进入分子水平，如抗原基因的克隆和表达、基因工程疫苗的 研制、球虫侵入相关基因以及球山持家基因的研究等。包括柔嫩艾美耳球虫卵囊 cdna文库的构建构建cdna表达文库理论上含有该生物体的所有表达基因，可 表达与天然蛋白相似的重组蛋白。建立cdna表达文库在一次永久保存基因资源的 同时,可以利用功能筛选、免疫学筛选、药物探针筛选和大规模序列测定等现代 分子生物学技术寻找特异性活性蛋白基因，进而克降和表达这些基因研究其功 能。目前这一技术已成为发现新的功能蛋白的重要手段，己利用杂交技术及rapd 方法鉴定并获得了一株柔嫩艾美耳球虫(e ten el

15、l a)不同地区分离株的杂交虫 株购，在此基础上本研究构建了柔嫩艾美耳球虫(庄tenella)杂交虫株f2 cdna 表达文库,为进一步利用其进行基因筛选工作奠定了基础。3. 5皖四地区鸡柔嫩艾美耳球虫的鉴定我们用球虫卵囊人t感染雏鸡，分离和鉴定球虫，主要是根据球虫卵囊的 形态、大小、颜色等特征，结合人t试验的过程及其病理变化等结果，并对试验 中卵囊进行测量和比较进行的，本次试验获得的指标与有关资料基木一致，少量 数据出现偏大或偏小，可能因为皖西地区长期使用药物防治鸡球虫病，而出现耐 药虫株变界所致，具体原因有待进一步探讨。4结论4. 1应用传统的形态学方法分离并鉴定鸡球虫，方法简便可行，结果

16、可靠性强。 4. 2本次实验从皖西地区养鸡场分离出一株鸡球虫卵囊，寄生部位在鸡盲肠段,初步鉴定为柔嫩艾美耳球虫(ehnenatenella)。4.3通过实验观察研究，分离出的柔嫩艾美耳球虫具有很强的致病力。参考文献：1 黄兵，沈杰，赵其平等中国鸡球虫种类与地理分布a.中国农业科学院上海家畜寄牛虫病研究所论文集，1992, (5)510.2 蒋金书动物原虫病学m北京:中国农业出版社,2002.3 孔繁瑶.家畜寄生虫学(第2版)m.北京：中国农业大学出版社.1997,4 索勋，李国清.鸡球虫病学m.北京：中国农业大学出版社.1998,5 林淸，于三科，陈秀荔，等鸡柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离技术的构建

17、及致病性研究j. 西北农林科技大学学报(自然科学版),2002, 30(3):3537.6 黄兵，赵其平，吴薛忠，等柔嫩艾美耳球虫纯种的初步确定和致病性研究j.上海畜 牧曾医通讯，1993, (5):1820.7 徐卫东，孙维东，王亮，等.堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫地方株分离与鉴定j. 辽宁畜牧医，1993, (5) :57. 陶建平，符敖齐柔嫩艾美耳球虫和冃型艾美耳球的分离与鉴定j.畜牧与兽医，1997, 29(6):248249.9 chapman hd.advances in the control of parasitic disease of poultry a. in proceedings international eongress of world poultry association m. cairo-egypt722, sept.2001.5961.10 m广孚，m增义柔嫩艾美耳球虫子饱子的提纯j.中国曽医杂志，1989, 15(4) :2728.11 缪徳年，樊生超，姚慧鹃，等鸡球虫虫种分离