断裂基因与重叠基因

1、七章基因精细结构遗传分析第一节基因概念第二节第三节第四节重组测验互补测验缺失作图第五节断裂基因与重叠基因第五节基因功能教学内容要点基因的概念、重组测验、互补测验、 断裂基因与重叠基因、基因的功能难点重组测验、互补测验与基因的功能F 1基因概念和精细结构III7门1基因概念的发展 遗传因子(孟德尔)1=(2) 染色体是基因载体(摩尔根)(3) DNA是遗传物质(肺炎双球菌的转化实验)(4) 基因是有功能的DNA片段(G. Beadle和E Tatum: 一基因二酶)(5) 操纵子模型(Jacob和Monod)(6) 跳跃基因和断裂基因的发现表7-1眼成虫盘移植实验供体受体移植眼的颜色(1)+V鲜

2、红(2)v+鲜红(3)+cn鲜红(4)cn+鲜红(5)cnV橙红(6)Vcn鲜红+ 鲜红的(bright red), v:桔黄色眼(vermilion), cn橙红色眼(cimnabaT)，和暗红色眼(scarlet)。7. L 2基因的类别和相互关系(1)结构基因1= (2)rRNA 和 tRNA 基因 (3)启动子和操纵基因2基因的类别及其相互关系根据基因的功能和性质，分为:（一）结构基因（structural genes）与调节基因（regulatory genes）（二）核糖体 RNA基因（ribosomal RNA genes，简称 rDNA）与转移 RNA基因（transfer R

3、NAgenes,简称tDNA）（三）启动子（promotor）与操纵基因（operator）前者是转录时RNA聚合酶与DNA结合的部位；后者是调节基因产物阻遏蛋白或激活蛋白与DNA结合的部位，F13基因与DNA|=多数肽链由150300个氨基酸组成，按三联密码子, 须有450900个核昔酸对编码，加上基因内不编码的核昔 酸序列，一个基因约有5006 000个核昔酸对。并非DNA 分子上任一含有几千个核昔酸对的区段都是一个基因，基因 是一个含有特定遗传信息的DN A分子区段。 特定核昔酸序 列与其转录产物RNA核昔酸序列或翻译产物多肽链氨基酸序 列相对应就是基因，要同时测定某一段DNA的核昔酸序

4、列和 相应产物的序列。黑腹果蝇红眼由一个显性基因控制，位于X染色体上,果蝇眼睛还有许多其他颜色，如粉红色、杏色、伊 红、象牙色和白色等突变型。的,之间是复等位关系。用“+”代表野生型红色眼基早期研究认为控制这些眼睛颜色性状的基因是等位1=因，wa代表杏色眼基因，w代表白色眼基因，当杏色眼(wa/ wa )与白眼(w / Y)果蝇杂交时，F1为杏 色眼，如果砧与w是等位基因，F1应只有两种亲本表 型，但在大量F1群体中约有1 /1000野生型红眼果蝇。红眼的出现不是突变，因为突变没有如此高频率。r进一步研究证明杏色眼基因和白眼基因虽 燕在染色体上所占位置相同，即位于同一基因, 但属于不同位点，之

5、间可发生交换。如杏色0gwa+ + /wa + x白眼w/Y, F1杏色眼。Wa +/+ W和W a +/Y,F1雌蝇减数分裂时发生交换形成+与Ww配子，+配子与任何其他配子结合所形成的F1个体均表现为野生型红 对唁色眼w+/+w与野生型+/ Wa W两种个体 进行比较发现，基因组成一样，但排列不同， 前者两个突变分别在两条染色体上，为反式眼果蝇，因而F1群体中出现野生型个体。II(trans)排列，后者则是两个突变同时排在一条染色体上，而另一条染色体上两个位点均 正常,为顺式(cis)排列。_反式排列表现为突变型，顺式排列为野生型。这种由于排列方式不同而表型不同的现象称为顺反位置效应(cis

6、-trans positioneffects),并将这种紧密连锁的功能性等位基因，但不是结构性的等位基因称为拟等位1=基因(pseudoallele)。拟等位基因的发现证明了基因的可分性。7*2 噬菌体突变型1=S. Benzer对大肠杆菌噬菌体T4的r IIA和r IIB两 个基因的结构分析，证明了基因的可分性，基因内有 大量的突变子和重组子。噬菌体的突变型可归为：噬菌斑形态突变型：一些是由于侵染寄主后溶菌速 度的快慢而形成大小不同的噬菌斑(plaque)；另一 些是由于被感染细菌是全部或是部分被杀死而形成清 晰或混浊的噬菌斑。可寄主范围突变型:NF巳噬菌体感染细菌时，首先吸附于细胞表面专一

7、受体 上，由受体基因控制，如果受体发生改变，可能使噬 菌体不能附着，从而该噬菌体的寄主范围缩小。另外 噬菌体突变也可扩大寄生范围。因为决定噬菌斑形态 和宿主范围突变的基因在其基因组中相当狭窄的特定 区段里，大多数基因涉及生命过程必不可少的功能， 所以上述突变通常是致死的。条件致死突变型:条件致死突变型在遗传学研究中具重要意义，通 过这种突变已鉴定出噬菌体的大部分基因。Benzer所用T4的r II突变就是遗传学研究中所用的第一个条件致死突变型oT4噬菌体有多个迅速裂解突变型，分别称 为rl, r II, rill等,它们位于染色体DNA的 不同区段，这3组突变型由于在大肠杆菌不同菌株上的反应不

8、同可以相互区别。T4 r II突变使所侵染细胞迅速裂解形成大噬菌斑，所以称为r II突变型。Benzer对r II区域的突变进行了分析：r II突变感染大肠杆菌B菌株后迅速裂解，形成比野生型大的噬菌斑，从而从大量的卄中筛选出II。另外HI突变型感染带有原噬菌体的大肠杆菌K (A)菌株时，不产生子代，而野生型T4 rll在大肠杆菌K (A)菌株中能正常增殖，由此也很容易在rll噬菌体中检出HI+噬菌体，所以可检出两种不同的HI突变型之间重组频率极低的重组子。单独感染E.coli K单独感染E.coli K混合感染E.coli Kenzer的噬菌体重组实验丄 Benzer 以T4 噬菌体为材料 进

9、行了研究工 作，正式提岀Discovery of RecombinationWithin the GenerllAmutantrllBmutant“顺反子”这 个术语不能正常生长能正常生长不能正常生长rllA顺反子概念和基因内重组Discovery of RecombinationWithin the GenerllA4- Benzer将 两个rllA突 变型对B株进 行混合感染, 再让释放的 了代噬菌体 感染K株。丄岀现了野 生型噬菌体。m 1Chromosome carringmutation 1Chromosome carringmutation 1 and 2Recombination

10、 withinthe genem2Chromosome carringmutation 2Wild type作图精细rWr47十+r!02Tr taU 粧7.3.1互补测验原理和方法基础遗传学研究首先须有突变型，然后分析突变型间的关系。重组测验与互补测验是确 定这种关系的两个基本方法。重组测验以遗传图距确定突变的空间关系,而互补测验则是确定突变的功能关系O如rll区有3 000多个突变型都有相同表型,这是由于所有的r II突变都导致丧失合成Eco K(入)发育所需要一种或几种蛋白质能力，这些 突变型对E.coli K(A)寄主细胞致死，但可在 E.coli B菌株细胞中增殖。既然它们有相同表型

11、，是否它们都影响 同一种遗传功能？ HI中这3 000多个突变型是 属于一个基因还是属于几个基因？为划分这种 功能单位界线，要进行互补测验。菌K（入）菌株：如果被双重感染的细菌中产生两种亲代基 因型的子代噬菌体（也有少量重组型的噬菌 体），那么必然是一个突变型补偿了另一个突 变型所不具有的功能，两个突变型称彼此互补（complementation）。如果双重感染的细 菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变型一定 有一个相同功能受到损伤。互补测验斑点测试法(spot test)1用一种rl快变型以0.1感染比(噬菌体1/细 菌10)感染E.coli K(A)菌株。噬菌体和细菌在温 热的琼脂中混合，涂

12、布在平板，琼脂凝固后在平 板上划出的一定位置上再加一滴含另一种r II突变 型的培养基。在这一滴培养基范围内，一些细菌 会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌 斑，证明这两种突变型互补，相反不能互补。在 一个培养皿平板上可做68个斑点试验。 CDMA和r】B的冥变型可议互祚重组检出率达1/106,理论上该方法测定重组频率极敏感，可测得0.002%的重组值，实际上所观察的最小重组频率为 002%。根据二点杂交的结果，可作成连锁图。F互补测验结果发现，除一些缺失突变型外，rll突 却可分成r IIA和r IIB两个互补群。I rllA突变型的突变位点都在rll区的一头，是一个独 立的功能单位；

13、所有rllB突变型的突变位点都在rll区的另一头，也是一个独立功能单位。凡属rllA的突变之间不能互补；同理属于IIB的突变之间也不能互补，只有HIA的突变和rllB的突变间可 互补，双重感染E.coli K(A)菌株后可产生子代。说明r 和r是两个独立的功能单位，分别具不同的功能，但它们又是功能互补的，要在EcoWK(入)菌株中增殖，两种功能缺一不可。可见rll 是由于这两种遗传功能丧失而成的o10651门06 +51测验r47+FT7+rI06K菌株丿B菌株a) ComplementationE. coli Ki2a)DefectiveB product (nonfunctional)Ph

14、age with mutation in rllAPhage with mutation in rllBDefective A product (nonfunctional)Functional B productFunctional A productProgeny phage producedPlaques formed on lawn of E. coli Bb) No complementationE. coli K12aPhage with mutation in rllADefectiveA product (nonf unctional)DefectiveA product (n

15、onfun ctio nal)Phage with mutation in rllAFunctio nalB productFuncti onal B productNo progeny phage producedNo plaques formed on lawn of E. coli B顺式测验反式测验5L我明侧个突变不能互补是发生在同一顺反于中的契变非竽位突变5L我明侧个突变不能互补是发生在同一顺反于中的契变非竽位突变突变位点 在同一顺 反子内突变位点 在不同的 顺反子内图5-20顺反测验结果的图解。当顺式有功能，而反式没有功能时，突变 位点突变位点在同一顺反子内；当顺式有功能，而反式也

16、有功能时，突变 位点突变位点在不同顺反子内。同一顺反子中的两个突变A SEE B亚区1££一_'1 噬菌体顾式1T»-1 噬菌体 2野生劇1S'1 履菌丼 3仪式1一>1噬曲休4+b突变塑(AB*)不同顺式反了中的柄个突变顺式i寸噬肃休1I程菌体25F生型(A+B+)反式二ZZ+J_-噬菌体31b噬菌体4野宅型(A/)图33顾反子互补试验a和b艮極个突嚨：两个噬繭体仃和2或3和4)J£.反式杂令子如果是突变5L我明侧个突变不能互补是发生在同一顺反于中的契变非竽位突变Benzer将不同突变间没有互补的功能区 称为顺顺反子(cistro

17、n) o 一个顺反子就是 为基因的同义词。一个功能水平上的基因,因此常用顺反子作_&QJJ1SMxJ1A是一个顺反子，rllB另一个 顺反子。每个顺反子在染色体上的区域称为基 因座，而每个基因座中有若干个突变位点，是 顺反子内部能发生突变的最小单位。DNA中每 一核昔酸对改变都可引起多肽链中氨基酸改变, 从而影响顺反子功能。它们本身没有独立的功 能，在它们之间可以重组。由此可见顺反子既具有功能上的完整性， 又具有结构上的可分割性。基因内互补互补测验中已知同一顺反子内两突变不能互补，但有例外：发生于同一基因内两个不同位点突变致使两条原来相同的多肽转变成两条分别在不同位点上发生变异的多肽链

18、，而后将这两条多肽构成双重杂合子，两者配合起来,可表现程度不同的恢复酶活性部位，称为基因内互补 (intragenic complementation)。r基因内互补对互补测验存在一定干扰,通过研究发现，基因内互补与基因间互补可区分开:1= 基因间互补普遍存在，而同一基因内不同位点突 变绝大多数不能互补，只有少数例外。 基因内两个突变能互补的只能是点突变，无缺失,突变一定是错义突变，不是无义突变或移码突变;基因内互补作用的酶活性明显低于正常水平，最 多只有野生型酶活性的25%,形成的蛋白质常有某 种异常，如温度的稳定性或pH依赖性等。7.4缺失作图科1缺失作图原理BenzerCT究r II突变

19、型时发现一些突变由于核昔酸对发 生改变，称点突变(point mutation)。而另一些突变由于缺失 相邻的许多核昔酸对，称缺失突变(deletion mutation)o尽 管两种突变形成相同表型效应，但有区别： 点突变是单个位点突变，缺失突变是多个位点突变(multisitemutation)；| 点突变可发生回复突变，而缺失突变不可逆； 点突变与其他点突变间可发生重组，而缺失突变同另一个点突变间不能重组，因为相应片段已缺失。这个杂交中没有 一个基因组在这个点突变位置上正确的核昔酸对，无法通过 重组而恢复野生型核昔酸顺序。辺叵囤亂4.2 缺失作图方法C70. 5ml E. coli B菌

20、株培养物加1滴缺失型噬菌体和1滴 待测r II突变噬菌体，几分钟后取一滴菌液加在灭菌纸条 上，铺在长有E. coliY. (A)菌株平板上，经培养如在纸条覆 盖区域内形成清晰噬菌斑，说明它们之间发生重组，产生 野生型噬菌体，阴性结果就说明子代中重组体非常低，空 白对照出现几个噬菌斑是点突变回复突变产生的。通过两个步骤把未定位的r II突变定位在r II区域 某个小片段上。第一步将待测突变型与“大缺失”突变型 分别进行杂交，以确定这一突变位点所属大范围；第二步 将待测突变型进一步与有关“小缺失”突变型分别进行杂 交，以缩小这一突变点所属的范围。如待测突变型r II 548,第一次杂交结果说 明它

21、和缺失突变型A105和638发生重组，而与 其他5个不发生重组，确定这一突变位点在区 域A5中；第二步与A中3个缺失突变型1605、 1589、PB230分别进行杂交，同一原理可把rll 548进一步定位在A5某一位置上。用该方法已 绘制出r们区域自发突变的精细结构图。P203可见测定每一个r II突变型位置需做两次实验，虽然每次实验要做若干杂交组合, 但杂交在同一培养皿上用滴加法进行，实际测定工作很简单。适用于测定大量突变型定 位，只需确定这些突变型彼此间的位置。这一方法还可应用选择性培养方法提高效率， 而且杂交后只需观察能否重组，而无须统计 重组子的多少。彷法也适用于其他基因定位。Benz

22、er根据这一原理方便地把数千个独立的r II突变定位在r II遗传图上更小的区段内， 这种方法称为缺失作图(deletion mapping)。比重组作图简便且精确。因为重组作图工作量 大，为了确定一个新突变的位点，往往要进行 大量杂交分析。F缺失作图须有一组重叠缺失突变索作工具, 矗要测定的突变型和这一系列缺失突变型分别 进行重组测验。凡能和某一缺失突变型进行重 组的，它的位置一定不在缺失范围内，凡不能 重组的，它的位置一定在缺失范围内。Benzer 所选择的一组缺失突变就将川区划分成47个片 段，只需做十几个杂交，而且只要记录K（入）平板上是否出现重组体，就能将一个新的rII突变位点定位在

23、r II区47个片段中。7.5断裂基因与重叠基因.1外显子与内含子卡统躺每一结构基因是一段连续的DNA序列。法 国Chambon (1977)和美国Berget首次报道基因内部有间隔顺序(space sequence)。提出断裂基因(split gene)指基因由几个互不相邻的段落组成，内部被长达数百个乃至上千个核昔酸对的间隔序列(内含子)隔开。自从在猴 类病毒SV40和腺病毒中发现断裂基因以后，又发现珠蛋白基 因、卵清蛋白基因、免疫球蛋白基因、tRNA基因、RNA基 因均是断裂基因。高等真核生物基因多数都有内含子，只有 少数基因没有内含子。原核生物的基因一般无内含子。M叵回丁 1977年Fl

24、avell和Jeffreys将兔0珠蛋白基因mRNA反转录 成:DNA,然后再与0珠蛋白基因杂交，结果发现0珠蛋白基 因片段比cDNA大两倍，说明0珠蛋白基因内部含有不属于cDNA的片断，即不出现在mRNA分子中的非编码序列。同年,Chambon对鸡输卵管的卵清蛋白基因做了同样的实验，并在电 子显微镜下观察，得到了直接证据和相同的结果：、C、D. E、F和鸡卵清蛋白基因(ovalbumin gene) mRNA 比该基因DNA短很多。用该mRNA与卵清蛋白DNA 杂交,或者先以mRNA为模板反转录出互补cDNA, 然后用这种cDNA与卵清蛋白DNA杂交，再用电子 显微镜观察照相，结果表明A、G

25、等DNA序列在成熟的mRNA中未能反应出来。的，只是有些片段找不到可和它配对的mRNA,于是这段DNA拱起来。拱起来的DNA序列 可能未转录，至少在成熟的mRNA序列中没有这部分 DNA的转录产物。将DNA序列中被转录成为mRNA的片段称为外显 子(exon或extron),而在成熟mRNA未转录的 DNA区段为内含子(intron)。卵清蛋白基因含7个内含子，将基因分隔为8个外 显子，还有一前导序列。由此Gilbert提出基因是由被 表达的外显子镶嵌在沉默的内含子中的一种嵌合体， 而且内含子的核昔酸数量可比外显子多510倍。断裂基因的意义研究表明，真核生物基因中存在断裂基因具有 普遍性，那么

26、在进化中又有什么意义？有利于储存较多的信息，增加信息量。一个基因 只转录出一种mRNA,但是一些断裂基因以不同剪 接方式可产生两种至多种mRNA,编码不同功能的 多肽。如SV40的同一段DNA在一种情况下读成一 种蛋白质，在另一种情况下读成另一种蛋白质。有利丁变异和进化。虽然单个碱基改变有时可引起氨基酸改化而造成蛋白质变化，但很难 产生重大改变而形成新蛋白质。如果这些单个碱基突变发生在密码子第三位上往往沉默，突 变效应会大大降低。而断裂基因中如果突变发 生在内含子与外显子结合部位，就会造成剪接 方式改变，结果使蛋白质结构发生大幅度变化, 从而加速进化。增加重组机率.内含子可能不断增减造成 新的

27、剪接方式。一方面形成新基因，另一方面在剪接过程中增加重组频率；同时断裂基 总之亠価M 因是具有十分重要的生物学意义 的，但是对它的功能还不是完全了解。因中由于内含子的存在,基因长度增加,组频率也增加。可能是基因调控序列。内含子可能在基因表达中有一定调控作用,在基因转录水平上以及在合成mRNA以后的加工过程中起着调控基因表达的作用。如inIB剪接作用是通过什么机制来识别内含子与外 显子的结合特定位点？如果通过酶进行，那么 这种剪接酶是否有特异性？ 一种酶还是多种酶 参予作用？因为这种剪接必须十分准确，只要 切错一个核昔酸，就会使密码全部弄错。率内含子是一次切除还是多次切除？切除的RNA运又如何？

28、是否可作为形成mRNA的原料？内含子是如何形成？有人认为一切生物原来都有内含子，但原核生物由于基因组小，复制快,1=内含子成为快速复制的包袱，因此逐渐失去；相反的看法认为生物体本来没有内含子，由于外显子改组(shuffling)位置不准确而形成内含子。这两种看法都有一定的旁证，但仍难作出正确判断。这些问题都有待进一步研究。5,3(overlapping gene)的发现重叠基因：两个基因的核昔酸序列完全重叠或 部分重叠的情况，即一段核昔酸片段被两个基因 重复使用的现象。1=1=1973年哈佛大学Weiner首次发现E co"的Q卩 病毒有两个基因编码蛋白质从一个起点开始。 1977年

29、Sanger测定出噬菌体卩力74核昔酸序列为 5375bp （现5387）,它编码9种蛋白质的aa长度 明显超过5375bp能编码的aa最大数目，后来发现 了其基因组中有多种重叠的情况。GCGAhgAARluGGAgiyBBgigVa/丿肚闲迪 fmetTg曹）大基因内包含小基因。如B基因完全包含在A基因内；E 基申在D基因内由于密码读框不同而得到不同蛋白质。（i）前后两个基因首尾重叠。如D基因终止密码子最后一个 核昔酸是J基因起始密码子的第一个核昔酸；还有前后重叠两 个核昔酸，如A基因与C基因之间就重叠两个核昔酸。（三）3个基因之间三重重叠。Shaw （1978）对噬菌体G4核 昔酸序列分析

30、时发现3个基因间的三重重叠。（四）反向重叠。DNA双链都转录，密码读框相同，但方向不 同，所以形成不同的蛋白质。不过这两者的转录相互干扰，表 达一强一弱。|=（五）重叠操纵子。重叠基因不仅结构基因之间重叠，也有结 构基因与调控序列重叠，以及调控序列之间重叠，如大肠杆菌 中的md和ampC两个相邻的操纵子的重叠。1=-L普遍认为重叠基因不仅能经济有效利用DNA遗传 漕息量，“节约”碱基，而且更重要的是便于对基因 表达起调控作用。1=如Trp操纵子中i m p基因翻译依赖于上游基因 trpE的翻译，称为翻译偶联(tanslational coupling)。因为trpE的终止密码子与imp的起始密 码子重叠。这种重叠密码子是保证同一个核糖体对两 个连续基因进行翻译的机制。实验证明，翻译偶联是 一种调控机制。已知噬菌体MS2和猿猴病毒SV40都具有重叠基因。显然这些病毒可以用有限DNA执行更多的遗传功能，这是提高遗传 物质效率的一种适应性表现。高等真核生物中也有重叠基因，一个基因的内含子是另一个基因的编码序列O在果蝇中，编码果蝇蛹的角质层蛋白基因,位于编码瞟吟代谢路线中一种酶基因的内含子 序列中。_基因中也发现重叠基因。一种常1=1=染色体显性遗传病是由I型神经纤维瘤（NFI）基 因引起。克隆该基因后分析发现它的第一个内含 子中包含了另外3个基因，其中两个基因编码