第9章吸光光度法

1、1第第九九章章 吸光光度法吸光光度法9.1 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理9.2 光度计及其基本部件光度计及其基本部件9.3 显色反应与条件的选择显色反应与条件的选择9.4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择9.5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用2 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法，主要有方法称为吸光光度法，主要有: 红外吸收光谱：红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围分子振动光谱，吸收光波长范围2.5 1000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：电子跃

2、迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围200 400 nm（近紫外区）近紫外区） ，可用于结构鉴定和定量，可用于结构鉴定和定量分析。分析。 可见吸收光谱：可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围400 750 nm ，主要用于有色物质的定量分析。主要用于有色物质的定量分析。 此外还有此外还有比色法比色法。什么叫吸光光度法什么叫吸光光度法? ?3灵敏度高灵敏度高 ：检测下限达到检测下限达到10-510-6准确度准确度 能够满足微量组分的测定要求：能够满足微量组分的测定要求： 相对误差相对误差25操作简便快速操作简便快速应用广泛应用广泛特点特点49.1 吸

3、光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理9.1.1 物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收溶液的颜色由透射光波长还是由入射光波长决定溶液的颜色由透射光波长还是由入射光波长决定?5678 /nm颜色颜色互补光互补光400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-600黄黄蓝蓝600-650橙橙绿蓝绿蓝650-780红红蓝绿蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光不同颜色的可见光波长及其互补光9吸收光谱吸收光谱 被激发的粒子在被激发的粒子在1010-8-8s s后又回到基态，并以热或荧光等形后又回到

4、基态，并以热或荧光等形式放出能量。式放出能量。 当一束光照射到某物质时，组成该物质的分子、原子或离子当一束光照射到某物质时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生碰撞，光子的能量被分子、原子或离子所吸收，使这与光子发生碰撞，光子的能量被分子、原子或离子所吸收，使这些粒子由最低能态跃迁到较高能态：些粒子由最低能态跃迁到较高能态：h M +M*10 物质的电子结构不同，具有不同的量子化能级物质的电子结构不同，具有不同的量子化能级, , 其能量差也不同其能量差也不同, , 吸收光的波长也不同，这就构成吸收光的波长也不同，这就构成了了物质对光的选择性吸收基础物质对光的选择性吸收基础. . 仅当照射光的

5、光子能量仅当照射光的光子能量(hv)与被照射物质粒子的基态和激发与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时才能发生吸收。态能量之差相当时才能发生吸收。11吸收光谱吸收光谱300400500600700 / nm3501.00.60.2525 545Cr2O72-MnO4-350A12v吸光度A：每一波长下溶液对光的吸收程度v吸收曲线：纵坐标为A，横坐标为，即可得吸收曲线，它描述了物质对不同波长光的吸收能力。v最大吸收波长maxA C增增大大13定性分析基础：定性分析基础：定量分析基础：定量分析基础：不同物质吸收光谱不同物质吸收光谱的形状以及的形状以及 max不同不同同一物质，浓度不同同一物质

6、，浓度不同时，吸收光谱的形状相时，吸收光谱的形状相同，同，Amax不同不同ABA )(maxA)(maxBA C增增大大149.1.2 光的吸收基本定律光的吸收基本定律: 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律A = lg(1/T) = -lgT= lg(I0/I)=abc液层液层bcm溶液浓度溶液浓度cgL-1吸收系数吸收系数aL g-1 cm-1T透光度透光度0IIT 全部吸收全部吸收T = 0.0 %全部透射全部透射T = 100.0 %15 影响影响的因素的因素入射光波长入射光波长物质的性质物质的性质溶剂和温度溶剂和温度Lmol-1cm-1当当c的单位用的单位用molL-1表示时，用表示时，用表示

7、表示. =Ma 摩尔吸收系数摩尔吸收系数， A bc 16（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数特征常数；（2）不随浓度不随浓度c和液层厚度和液层厚度b的改变而改变的改变而改变。在温度和。在温度和波长等条件一定时，波长等条件一定时， 仅与吸收物质本身的性质有关，仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；与待测物浓度无关；（3）同一吸收物质在不同波长下的）同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最值是不同的。在最大吸收波长大吸收波长max处的摩尔吸收系数处的摩尔吸收系数 max表明了该吸收物表明了该吸收物质最大限度的吸光能力质最大限度的吸光能力，也反

8、映了光度法测定该物质可，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度能达到的最大灵敏度。 摩尔吸收系数摩尔吸收系数的讨论的讨论17（4）可作为）可作为定性鉴定的参数定性鉴定的参数；（5）物质的吸光能力的度量物质的吸光能力的度量 max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测 定该物质的灵敏度越高。定该物质的灵敏度越高。 105：超高灵敏；：超高灵敏； = (610）104 ：高灵敏；：高灵敏； = 104 103 ：中等灵敏；：中等灵敏； 104*选择性好选择性好*显色剂在测定波长处无明显吸收。显色剂在测定波长处无明显吸收。对比度对比度： max60 n

9、m319.3.2 显色条件的选择显色条件的选择c(R)c(R)1. 显色剂用量（显色剂用量（cM、pH等条件固定）等条件固定）Mo(SCN)32+ 浅红浅红Mo(SCN)5 橙红橙红Mo(SCN)6- 浅红浅红M + R M R32副副 反反 应应M + nR = MRnOH-H+ 型型 体体 的的 变变 化化RH = R- + H+ 1 2生成不同配比的配合物生成不同配比的配合物例：例：磺基水杨酸磺基水杨酸 Fe 3+pH = 2 3FeR紫红色紫红色pH = 4 7FeR2橙色橙色pH = 8 10FeR3黄色黄色2. 酸度（酸度（cM、 cR一定）一定）酸度的影响酸度的影响33pH1pH

10、pH2pH343. 显色温度显色温度实际工作中，作实际工作中，作 A T 曲线，寻找适宜反应温度曲线，寻找适宜反应温度.ATATATAT354. 显色时间显色时间T1()T2()t(min)A实际工作中，作实际工作中，作A t 曲线，寻找适宜反应时间曲线，寻找适宜反应时间.t(min)A365.干扰的消除（本身具有颜色或与显色剂作用）干扰的消除（本身具有颜色或与显色剂作用）Co2, Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2 (蓝蓝)NaFSCN例：例：测测Co2(含含Fe3+)1)加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂。 37例：例：测测Fe3 (控制控制pH)Fe3

11、+, Cu2+FeSSal （紫红）紫红）Cu2+pH 2.5SSal2)选择适当的显色条件以避免干扰选择适当的显色条件以避免干扰。 3)分离干扰离子分离干扰离子可选择适当的光度测量条件（例如适当的波可选择适当的光度测量条件（例如适当的波长或参比溶液），消除干扰长或参比溶液），消除干扰。4)389.3.3 显色剂显色剂1.无机显色剂无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、：硫氰酸盐、钼酸铵、 过氧化氢等。过氧化氢等。2.有机显色剂：有机显色剂：种类繁多种类繁多偶氮类显色剂：偶氮类显色剂：性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂性好、对比度大，应用

12、最广泛。偶氮胂III、PAR等。等。三苯甲烷类：三苯甲烷类：铬天青铬天青S、二甲酚橙等、二甲酚橙等39有机显色剂有机显色剂生色基团生色基团：能吸收紫外能吸收紫外-可见光的基团。可见光的基团。 偶氮基、硫羰基、亚硝基偶氮基、硫羰基、亚硝基等等助色基团：助色基团：本身无紫外吸收，但可以使生色团本身无紫外吸收，但可以使生色团 吸收峰加强同时使吸收峰红移的基团。吸收峰加强同时使吸收峰红移的基团。 胺基、羟基胺基、羟基等。等。409.4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择9.4.1 选择适当的入射波长选择适当的入射波长 一般应该选择一般应该选择max为入射光波长。为入射光波长。 如果如果max处有

13、共存组分干扰时，则处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。的入射光波长。 如图选如图选500nm波长测定，灵敏度虽有波长测定，灵敏度虽有所下降，却消除了干扰，提高了测定所下降，却消除了干扰，提高了测定的准确度和选择性。的准确度和选择性。419.4.2 参比溶液的选择参比溶液的选择 为什么需要使用参比溶液？为什么需要使用参比溶液？ 测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。试液参比IIIIAlglg0 选择参比溶液所遵循的一般原则：选择参比溶液所遵循的一般原则： 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波

14、长处有若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其他所加试剂均无吸收，用吸收，其他所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水纯溶剂（水) )作参作参比溶液；比溶液；42 若显色剂、试液中其他组分在测量波长处有吸收若显色剂、试液中其他组分在测量波长处有吸收,则则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。剂，作为参比溶液。 若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用则可用“试样空白试样空白”(待测液不加显色剂待测液不加显色剂)作参比溶液作参比溶液； 若显色剂或其他所加试剂在测

15、定波长处略有吸收若显色剂或其他所加试剂在测定波长处略有吸收,而试而试液本身无吸收，用液本身无吸收，用“试剂空白试剂空白”(不加试样溶液，也叫空不加试样溶液，也叫空白溶液白溶液)作参比溶液；作参比溶液；43 9.4.3 吸光度读数范围的选择（准确度吸光度读数范围的选择（准确度仪器测量误差仪器测量误差）不同的透光度读数，产生的误差大小不同不同的透光度读数，产生的误差大小不同： lgT= bc 1微分：dlgT0.434dlnT = - 0.434T -1 dT = b dc - 0.434T -1 dT = b dc 2两式相除(2/1)得：c/c：浓度相对误差浓度相对误差，即所测结果的相对误差；

16、，即所测结果的相对误差；T：仪器透光度的绝对误差，由仪器性能（仪器刻度读数不仪器透光度的绝对误差，由仪器性能（仪器刻度读数不 可靠）决定。一般可靠）决定。一般T 0.22T：实验时实验时透光度读数。透光度读数。TTT.ccdlg4340d0.434lgcErTcTTA=lgT= bc44c/c(浓度相对误差浓度相对误差)不仅与不仅与T（仪器的透光度绝对误差）（仪器的透光度绝对误差） 有关，而且与其透光度有关，而且与其透光度读数读数T 的值也有关。的值也有关。是否存在最佳读是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？数范围？何值时误差最小？0.434lgcErTcTT设：设：T =0.5%，将不同将不

17、同T值带入上值带入上式得式得c/c T 关系曲线关系曲线T 在在 70%10%（A在在0.151.0 ） 之间时之间时, 浓度相对误差较小（浓度相对误差较小（Er=1.4%-2.2%），）， 最佳读数范围最佳读数范围459.5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用一、一、普通分光光度法普通分光光度法1.单组分的测定单组分的测定 A- c 标准曲线法定量测定。标准曲线法定量测定。A=lgT= bc46步骤步骤: :1）选择显色反应）选择显色反应2）选择显色剂）选择显色剂3）优化显色反应条件）优化显色反应条件4）选择检测波长）选择检测波长5）选择合适的浓度）选择合适的浓度6）选择参比溶液）选择参比溶液

18、7）建立标准曲线）建立标准曲线8）样品测定）样品测定c1吸收曲线吸收曲线标准曲线标准曲线注意注意 : : 标准溶液和样品的配制方法，工作曲线的制作和样标准溶液和样品的配制方法，工作曲线的制作和样品测定时，所使用的仪器、条件必须一致。品测定时，所使用的仪器、条件必须一致。472、 多组分含量的测定多组分含量的测定多组分样品的吸收曲线有三种情况多组分样品的吸收曲线有三种情况I. 各组分吸收曲线的各组分吸收曲线的max互不干扰互不干扰在各自的在各自的max处处,按单组分的测定方法进行测定按单组分的测定方法进行测定A1=1 b caA2=2 b cb48II. a组分的组分的1处，处，b组分无干扰，但

19、组分无干扰，但 b组组 分的测分的测量量2处，处，a组分有吸收组分有吸收III. 各组分吸收曲线的各组分吸收曲线的max互有干扰互有干扰49二、酸碱离解常数的测定二、酸碱离解常数的测定用于测定对光有吸收的弱酸（碱）的离解常数。用于测定对光有吸收的弱酸（碱）的离解常数。 HL = H+L- HLLHaK(1) 配制一系列总浓度配制一系列总浓度(c)相等，而相等，而pH不同的不同的HL溶液溶液(2) 测定各溶液的测定各溶液的pH值。值。(3)在酸式在酸式(HL)或碱式或碱式(L-)最大吸收波长处，测吸光度最大吸收波长处，测吸光度。HLLHLL A50根据分布系数的概念根据分布系数的概念HLLHLL AHLLH H