模板制备PPT课件

1、PCR模板制备1 PCR的模板与制备PCR模板的使用粗样品中的PCR抑制剂中山大学药学院第1页/共46页PCR模板制备与纯化 DNA和RNA均可作为PCR扩增反应的模板，但一般情况下，mRNA先逆转录成cDNA再进行扩增。 PCR模板的来源主要有两大类：纯净物 如重组质粒、制备的染色体DNA、回收的DNA片段粗样品 如粪便、脑脊髓液、血液、食物、动物贝壳、土壤、尿液、唾液、福尔马林固定剂、组织切片、脓汁、喷嚏液、痰液等 第2页/共46页PCR模板的使用PCR模板的标准使用范围：102 - 105 拷贝 特异性的改进：增加模板DNA的量、降低引物与模板的分子比 有效性的改进：增加引物与模板的分子

2、比 模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般而言，模板DNA长度小，PCR扩增产物的量就大，因此对于大分子量的模板DNA（尤其是真核生物基因组DNA），在扩增之前最好先用超声波处理或限制性酶消化。第3页/共46页2 PCR的模板纯化核酸提取第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题及其对策第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取常见问题及对策中山大学药学院第4页/共46页基因组DNA的提取第一部分：DNA提取方法简介中山大学药学院第5页/共46页 CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并

3、与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。中山大学药学院第6页/共46页qCTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，

4、并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除第7页/共46页qCTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。中山大学药学院第8页/共46页qCTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DN

5、A溶液第9页/共46页第10页/共46页q SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。中山大学药学院第11页/共46页q SDS法DNA提取缓冲液组份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%中山大学药学院第12页/共46页q SDS法流程图 （以动物组织为例） 动物组织细胞裂解上层溶

6、液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液第13页/共46页 吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料阴离子交换树脂磁珠高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。中山大学药学院第14页/共46页浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物中山大学药学院第15页/共46页q 非基因组DNA的提取质粒DNA的提取

7、碱裂解法 煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法中山大学药学院第16页/共46页q碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中山大学药学院第17页/共46页q碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DN

8、A溶液第18页/共46页q煮沸法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中山大学药学院第19页/共46页第20页/共46页q差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。线粒

9、体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来中山大学药学院第21页/共46页I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中中山大学药学院第22页/共46页最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的

10、新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）中山大学药学院第23页/共46页材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的

11、提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁第24页/共46页 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取中山大学药学院第25页/共46页q 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理中山大学药学院第26页/共46页q 多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1

12、/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。中山大学药学院第27页/共46页q 多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合q 盐离子的去除： 70的乙醇洗涤中山大学药学院第28页/共46页第29页/共46页第30页/共46页q异硫氰酸胍/苯酚法 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，

13、同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 中山大学药学院第31页/共46页 步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。中山大学药学院第32页/共46页RNA操作中的

14、要求 抑制RNase活性是提取RNA的关键 在实验中，严格控制内源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳 槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase 。 中山大学药学院第33页/共46页 一、 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：

15、有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。第34页/共46页二、常用的RNA酶抑制剂1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它

16、通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 第35

17、页/共46页RNA的分离和纯化- TRIzol试剂法原理： 首先用含有异硫氰酸胍和酚的一种单相液来裂解细胞，加入氯仿产生第二相，离心后，RNA存在于水相，经异丙醇沉淀水相中的RNA可用于Northern杂交分析、RT-PCR等；存在于有机相的DNA和蛋白质用乙醇和异丙醇连续沉淀而分别分离，得到的DNA大小约20Kb，适用于PCR的模板；回收的蛋白质主要用于免疫印迹分析。中山大学药学院第36页/共46页RNA的鉴定紫外法 260nm下OD值为1时相当于40g/mlRNA。取5lRNA样品于1ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比色并记录。定量分析： RNAA260核酸稀释倍数40/1

18、000（g/ml）纯度分析：A260读数在0.15-1.0之间才可靠。 RNA A260/A280=1.9-2.1 A260/A2801.9,有杂蛋白，用酚/氯仿抽提; A260/A2302.0，可能有盐未除尽。做RT前必需测RNA浓度，常用500ng或1ug 中山大学药学院第37页/共46页q 材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于70或20保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，70短期保存中山大学药学院第38页/共46页q 纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响