Optogenetics光基因学fss

1、OptogeneticsOptogenetics School of Life Science, PKU光遗传学及光学在其中的应用光遗传学及光学在其中的应用Photo courtesy: Nature ViodeoOpto: related with opticsGenetic: Expression, regulation of genesPhoto courtesy: Nature ViodeoAndNeuroscience.tw/neuroscience/Single-component optogenetics 单单组分光遗传学组分光遗传学197

2、9，Francis Crick提出： 神经生物学主要挑战控制脑中一种神经细胞，而使其他细胞保持不变。神经元的激活或者抑制行为的变化行为的获得或者缺失 神经元的变化复杂病理机制的研究阿兹海默症PET scanning 视蛋白视蛋白(Opsins)的发现的发现1971，Stoeckenius and Oesterhelt发现细菌视紫红质在光激发下有离子泵的作用；1977，Matsuno-Yagi and Mukohata发现盐细菌视紫红质；光照激发- 离子泵活动- 动作电位、神经冲动Stoechkenius et al, 1971离子通道与动作电位离子通道与动作电位动作电位与离子通道 神经细胞膜电

3、位为负； 膜内外离子浓度不同； 去极化膜电位上升，超极化膜电位下降； 动作电位与离子进出相关Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光遗传学未应用于神经学光遗传学未应用于神经学 外源蛋白质对脆弱的神经元造成伤害； 光电流太微弱、速度慢； 不满足Single-component strategy视蛋白的作用需要一个共同作用因子 all-tans retinal（全反式视黄醛）视蛋白与离子通道视蛋白应用于神经生物学开端视蛋白应用于神经生物学开端2005年8月， Karl Deisseroth课题组发表报告： 在神经元中只导入

4、视蛋白基因，而无其他化学物质导入，使得神经元在光照刺激下发生反应。 脊椎动物组织中有视黄醛，光控效果理想视黄醛结构Karl Deisseroth 1971 born， B.A. Biochemistry, Harvard; M.A. & Ph.D. Neuroscience, Standford; Creating CLARITY & optogenetics135光光遗传学领域的研究工作发展遗传学领域的研究工作发展Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience Keyword: bacteriorhodops

5、in Keyword:optogenetics135细菌视紫红质19711971盐细菌视紫红质1977,19821977,1982视紫红质通道蛋白1984,1991,20021984,1991,2002三种重要视蛋白的发现Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光光遗传学领域的研究工作发展遗传学领域的研究工作发展135细菌视紫红质在神经元和线虫行为获得中应用，20052005神经元与光纤的接触，光基因学在线虫行为缺失、哺乳动物行为获得中的应用，20072007通过轴突投射和重组酶实现的行为控制，闭环光基因学，200920

6、09视蛋白Opsin在神经学研究中的应用和设备发展Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光光遗传学领域的研究工作发展遗传学领域的研究工作发展 2010年Optogenetics被评为Nature年度技术，此后领域内跟进大量研究 光学 微电子 蛋白质工程 神经生物学Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience2010Nature2010Nature年度技术年度技术l光遗传学的由来与神经生物学研究l视蛋白的发现、离子泵作用l神经学家渴求的单组分研究工具l

7、光遗传学的发展进程l光遗传学的具体研究l光遗传中光学的作用以及待解决的问题光遗传学光遗传学光遗传学光遗传学l光遗传学的由来与神经生物学研究l光遗传学的具体研究l视蛋白的原理和开发l光遗传神经生物学研究过程l光遗传中光学的作用以及待解决的问题Optogenetics: controlling cell function with light, Nat. Method,2011视蛋白与神经细胞动作电位视蛋白与神经细胞动作电位激活型通道：阳离子自由进出，去极化更容易；抑制型通道：氢离子外流，或氯离子内流，膜电位超极化；激活和抑制叠加2012 Hideaki Kato et al视蛋白离子泵作用原理视

8、蛋白离子泵作用原理结构与功能光照结构域光谱吸收构象变化特定离子沿梯度进出X射线衍射得到ChR感光部分的结构细菌视紫红质H+泵示意图Inbal Goshen et al, Cell, 2011视蛋白家族视蛋白家族光遗传学神经研究的重要工具 视蛋白的光谱、峰值、半衰期数据方法方法：位点突变（蛋白质工程），基因组扫描 Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neurosciencePhoto courtesy, Guoshen, Stanford光遗传学光遗传学l光遗传学的由来与神经生物学研究l光遗传学的具体研究l视蛋白的原理和开发l光遗传神经生物学

9、研究过程l光遗传中光学的作用以及待解决的问题Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience, Nat.Neuronsci.,2015光遗传学神经研究过程光遗传学神经研究过程视蛋白基因转入视蛋白基因转入腺病毒转染视蛋白基因过程 通过腺病毒在神经细胞中导入视蛋白基因 Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光纤插入与颅顶固定光纤插入与颅顶固定兼给药和光线插入视蛋白注入点和光照区域的吻合改进：加转动关节，便于实验动物运动；固定光纤和金属片，减少对神经组织的伤害

10、，减小动物压力光纤装置示意图Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience视蛋白激发或者抑制动作电位效果验证视蛋白激发或者抑制动作电位效果验证光照刺激后动作电位记录结论： 光照可引起神经冲动光激发小鼠从冷冻状态的恢复光激发小鼠从冷冻状态的恢复The Microbial Opsin Family of Optogenetic Tools, Cell, 2011视频一 未导入视蛋白基因小鼠光照后无明显反应视频二 导入视蛋白基因小鼠在光线刺激下从冷冻状态恢复Optogenetics: 10 years of microbial op

11、sinsin neurosciencePhoto courtesy, Guoshen, Stanford光遗传学光遗传学l光遗传学的由来与神经生物学研究l光遗传学的具体研究l视蛋白l颅外装置l光遗传中光学的应用及待解决的问题l光源l光信号检测Optical neural interfaces, Melissa R. Warden et al, 2014光源的选择光源的选择1激光激光激光：laser diode、DPSS（全固态半导体激光器）视蛋白激发：1-5mW/mm2细胞组织反射和散射：100mV优点：定位准确，带宽窄缺点： 费用较高，$1,000 for 473-nm laser, $5,

12、000-10,000 for 590-nm laser； 激光光源比较脆弱，warm-up time比较长； 体积较大，需专用光学工具实现光纤耦合； 转接环：方便运动，价格&能量损失多位点光源输出光源的选择光源的选择2LEDLED: PN结中载流子复合，转化电能为光能LED置于颅外、皮质层，插入脑内，或者与光纤耦合深入脑内 价格经济（$300），便捷，有多个波段的发光 容易与已有的电生理通道对接缺点： 易造成局部过热，故不能插入大脑深处； 与光纤耦合能力较弱； 光带相对比较宽，对于bistable opsin的使用造成困难； 容易造成电流刺激伪迹;神经电生理工具光源的选择光源的选择2L

13、EDs ( ultrathin microscale inorganic LEDs)材料：GaN材料，蓝光方法：材料挤压后灌入针头，由针头注射进入组织间隙深处，粘合剂溶解，抽出针头Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014LEDs示意图IPD: inorganic photon detector;ILED: inorganic LED；光源的选择光源的选择2LEDs ( ultrathin microscale inorganic LEDs)优点： 体积50*50*60m，小于光纤(200m)； 减少神经细胞伤害、炎症； 可与其他材料的

14、条带一同注射，如热学材料、电生理感受器;局部过热问题： 0.3mm深度， 23.5mW/mm2-上升10Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014LEDs示意图 猴子等动物驯养时间成本、人力成本高，组织切片需要处死动物神经活动的光学信号神经活动的光学信号荧光化学物荧光化学物 Ca2+离子转录蛋白指示剂 （GECIs: genetically encoded Ca2+ indicators） 基于绿色荧光蛋白和钙离子结合域的蛋白，钙离子浓度变化导致荧光变化（激光激发） 变种完善：发出不同波长的荧光，基于细胞膜电压变化 小分子荧光染料：电压

15、或钙离子浓度 1.fast, sensitive, but not cell-type-specific 2.每次成像前都需要注射，可以持续几分钟到几小时光纤读取：反映较大范围内的神经元荧光情况神经活动的光学神经活动的光学读取读取光纤光纤 GCaMP3(基于GFP的钙离子指示蛋白) 激发：单模 检测：多模，16-channel PMT ； TCSPC(time-correlated single-photon counting)光子数量统计Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014 Ca2+ 染料注射：200-m，0.48-N.A. 光

16、纤，PMT收集和检测光子神经活动的光学读取神经活动的光学读取单光子与双光子单光子与双光子目标：精准读取，高时空分辨率单光子和双光子显微镜双光子和单光子显微镜原理双光子显微镜成像 双光子激发，非线性光学，荧光强度衰减与1/z2成正比，光强集中双光子与单光子激发的结果比较双光子与单光子激发的结果比较John Peter Rickgauer et al, Nat. Neuronsci, 2014Two Photon Excitation Vs Single Photon Excitation单光子与双光子比较： 单光子深度不超过50-100m； 双光子能穿透至500m，扫描时间较长，视野小，运动伪迹

17、参数：25g，7.5cm近红外激光：Ti:Sapphire 激光器能够于成像200-250m深度神经活动的光学读取神经活动的光学读取 双光子显微镜双光子显微镜微型双光子显微镜用于光遗传学In awake, freely moving rats, stable imaging was possible except during sudden head movements.A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 20

18、01神经活动的光学读取神经活动的光学读取 双光子显微镜双光子显微镜微型双光子显微镜用于光遗传学一对衍射光栅消除色散A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001双光子显微镜双光子显微镜信号扫描信号扫描A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neur

19、o, 2001压电材料获得光纤振动；二维不同频，300-800Hz信号扫描设计李萨如图形双光子显微镜双光子显微镜扫描相位矫正扫描相位矫正A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001解决驱动相位与扫描相位不一致发光位置的坐标定位相移补偿和定位双光子显微镜双光子显微镜信号控制系统信号控制系统A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution

20、 brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001信号控制系统运动伪迹明显： 扫描时间长，扫描视野小矫正方法： Heart-beat triggering scanning Licking correction with tunable lens Adaptive image-based movement compensation system双光子显微镜双光子显微镜缺点和矫正方法缺点和矫正方法微型双光子显微镜用于光遗传学A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014神经活动的光学读取神经活动的光学读取 单单光子显微镜光子显微镜特点： 仪器聚集在头部装置 成像速度快，运动伪迹少 工具量产性能参数： 600-800m视野，2.5m分辨率，每秒36-100帧微型单光子显微镜用于光遗传学目前光遗传学有待改进的地方目前光遗传学有待改进的地方Crystal structure of the