生物大分子分离技术研究进展

1、生物大分子分离技术研究进展摘要：生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸DNA和RNA以及多糖等。生物大分子分离技术是生命科学研究中的关键技术之一，当前各学科之间的交叉渗透为生物大分子分离技术的发展提供了更多的契机。本文对生物大分子分离技术进展做了综述，期望对分子技术的进一步研究提供基础。关键字：生物大分子 分离技术 进展1前言生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸（DNA和RNA)以及多糖等。生命科学的发展给生物大分子的分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究要求得到纯的，以及结构和活性完整的生物大分子样品，这就使得其分离技术在各项研究中起到举足轻重的作用。对生物大分子分离技术的研究和开发也就应

2、运而生。而且随着各学科之间的交叉渗透，材料化学、自动化技术等学科的发展也为生物大分子技术的发展提供了更多的契机。生物大分子的制备具有如下主要特点:生物材料的组成极其复杂(许多生物大分子在生物材料中的含量极微,分离纯化的步骤繁多,流程长;许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易失活"因此分离过程中如何防止其失活& 就是生物大分子提取制备最困难之处;生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、PH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据，突破这些难点，优化分离程序以获得符合要求的生物大分子样品。2传统的生

3、物大分子分离技术 常用的传统生物大分子分离方法有沉淀、透析、超滤和溶剂萃取等，它们都是一些较早就建立起来的分离方法，至今仍然被广泛应用。2.1沉淀法 沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量形式，最后称定其重量进行测定的方法，盐析法是其中的一种。在蛋白质领域，利用盐析法将蛋白质沉淀出来已经有80多年的历史。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加。球蛋白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出（盐析）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团

4、的影响，=。有机溶剂对于许多蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能产生沉淀作用。其引起沉淀的主要原因在于改变介质的介电常数以及类似盐析的争夺水化水现象。其优点是分辨能力比盐析法高，溶剂容易除去且可回收，沉淀的蛋白质不需要脱盐处理，缺点是有机溶剂易使蛋白质或酶变性，常采用降低温度的方法进行有效控制，而且有机溶剂使用量大，溶剂的使用及回收、储存都比较困难或麻烦。等电点沉淀法利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低"易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质可以利用此法进行初步的沉淀分离，此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白而不用于沉淀目的物。

5、非离子型多聚物是20世纪60年代发展起来的一类重要的沉淀剂，它们具有很强的亲水性和较大的溶解度，在溶液中可通过空间位置排斥作用使生物大分子、病毒和细菌等聚集沉淀。该法温和的操作条件和较高的沉淀效能"使得其经常被用于细菌#病毒#核酸和蛋白质的分离"其中应用最多的多聚物是聚乙二醇。2.2透析法自Thomas Graham1861年发明透析方法至今已有140多年,透析已成为生物化学实验中最简便最常用的分离纯化技术之一.在生物大分子的制备过程中,除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术，同时半透膜的材料也更加多样化，透析方式也更加丰富。透析法主要是利用小分子

6、物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。油常多用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状，外面用尼龙网袋加以保护，小心。加入欲透析的样品溶液，悬挂在清水容器中。经常更换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大，必要时适当加热，并

7、加以搅拌，以利透析速度加快。为了加快透析速度，还可应用电渗析法，即在半在半透膜旁边纯溶剂两端放置二个电极，接通电路，则透析膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动，而带负电共荷的成分如无机阴离子、有机酸等则向阳极移动，中性化合物及高分子化合物则留在透析膜中。透析是否完全，须取透析膜内溶液进行定性反应检查。2.3超滤法超滤是一种加压膜分离技术，自20世纪20年代问世后，直至60年代以来其发展迅速。很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。 超滤作为一种高效分离技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子的脱盐、浓缩和分级分离。超滤膜筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动

8、力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。但其也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到1050%的浓度。2.4溶剂萃取法溶剂萃取法是（用一种溶剂将产物自另一种溶剂，如水中提取出来以达到浓缩和提纯的目的）是20世纪40年代兴起的一项化工分离技术"，并很快应用到了生物分子的提取和分离上。最初是

9、用于抗生素有机酸#维生素等生物小分子的提取，最近几十年来随着与其它技术的结合而产生了一系列新的分离技术，如逆胶束萃取、超临界萃取、液膜萃取等，可以用于生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等的提取和精制。在液体混合物溶液中加入某种溶剂，使溶液中的组分得到全部或部分分离的过程称为萃取，溶剂萃取法是从稀溶液中提取物质的一种有效方法2。3.现代生物大分子分离技术3.1电泳技术及其他电泳现象于1808年被发现，在1937年由瑞典科学家Tiselius A首次将其作为一种分离技术所应用。随着电泳支持物的改进，电泳条件的完善，区带电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等技术逐渐建立起来，同时，在电泳模式上也有了极大的发展，

10、先后出现了圆盘电泳、垂直板电泳、脉冲电泳等，电泳分辨率也随之得到提高。3.1.1纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳纸上电泳和醋酸纤维素薄膜电泳是利用滤纸或醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳技术。纸电泳技术是最早使用的区带电泳，尽管分辨率比凝胶介质差，但因其操作简单，故应用较广，比如，分离、确定某些蛋白质，如糖蛋白、脂蛋白等，尤其是在分离氨基酸的混合物时，PE是一种很有价值的分析技术。特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面具有重要作用3。醋酸纤维薄膜电泳，与纸电泳相似，只是换用了醋酸纤维薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.10.15mm。由于醋

11、酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术4。3.1.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)在聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上添加去污剂十二烷基硫酸钠(简称SDS)蛋白质因为与SDS结合而带有大量电荷。从而消除蛋白质原有的电荷量差别，其泳动速度便主要和分子大小有关。这种SDS-聚丙酰胺电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度柱测和测定蛋白质分子量。SDSPAGE应用于提纯过程中

12、纯度的检测纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带。但如果蛋白质是由不同的亚基组成的它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDSPAGE具有较高的灵敏度一般只需要不到微克置级的蛋白质，而且通过电袜还可以获得关于分子量的情况5。3.1.3双向电泳双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)技术又称二维凝胶电泳技术，是目前常用的唯一一种能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，第一，采用等电聚集电泳。第二，采用了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。广泛应用于生物学研究的各个领域，其原理是将高分辨率的等电聚集电泳和SDS-PAGE电

13、泳联合组成双向电泳。3.1.4免疫电泳 免役电泳是电泳分析与沉淀反应的结合产物。该技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，二是将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开，再与抗体起反应，从而使本法更为微量化、多样化。因此，其应用范围日益扩大。该方法可以用来研究：抗原和抗体的相对应性；测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率；根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其他特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质；鉴定抗原或抗体的纯度。3.1.5电泳与其他联用技术毛细管电泳时带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中接其淌度或分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。其分离模式有：毛细管区带

14、电泳、胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等点聚焦，毛细管电色谱。毛细管电棘(EE)作为一种分离技术与质谱(MS)联用作为一种检测方法，在食品分析领域具有重要优势，因为它结合了毛细管电泳的强分离能力以及质谱在定性和确证方面的强大功能。近来，许多有关多维毛细管电泳分离技术的设想已被提出"有些还得到了初步的尝试，其分离的优势也得到人们的关注。与传统的分离方法相比，CE具有分离效率高、分析速度快、样品及试剂用量少等特点，使其成为极为有效的分离技术，广泛应用于分离蛋白质、糖类、核酸等多种物质6。毛细管电色谱是将常规色谱填料填充到毛细管中 , 或在毛细管内表面键合、涂敷固定相

15、, 以电渗流作为流动相的推动力 , 根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异和在电场中迁移速率的不同而实现分离的一种高效微分离技术。近年来 CEC 在分离分析生物大分子中应用较为广泛。不少研究工作者开始将研究方向转移到CEC分离分析生物大分子。如 Bandilla 等使用整体柱毛细管电色谱分离模型蛋白 , 并表明了蛋白质容量因子随流动相中有机溶剂的增加而增加 , 且获得了高分辨率7。CEC 结合了 CE 的高效性和 HPLC 的高选择性 , 是一种新型的微柱分离分析技术 8, 已成为蛋白质等生物大分子分离分析的方法 , 它的出现为蛋白质的分离分析提供了一条新的有效途径9。但目前 CEC

16、 主要是以电驱动流动相为分离模式, 操作中易产生气泡 , 使其受到很大的限制。加压毛细管电色谱 (PEC) 的出现解决了长期限制 CEC 广泛使用的问题 ,PEC克服了仅靠电渗流驱动的一些限制因素 , 可方便地对流动相组成、性质、流速进行调节 , 抑制气泡的形成 , 尤其能实现梯度洗脱 , 是 CEC 发展的重要方向10。3.2色谱技术 色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品 中的组分通过固定相时 ，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。色谱被认为是迄今人类掌握的对复杂混合物分离能力最强的手段。特别是液相色谱，大都在室温条件下进行；所有的流动

17、相可以是与生理液相似的具有一定pH 值的含盐的缓冲水溶液 ，有时也使用某些能与水互溶 的有机溶剂；所用填料的表面经过了各种相应的化学修饰和覆盖，这样就为生物大分子的分离提供了温和的条件和软接触表面，有利于它们保持原有的构象和生理活性。所以液相层析作为生物大分子的分离重要方法具有很大的发展前景 。据分离机制不同，液相色谱可分四大基础类型 ：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶色谱，可根据生物大分子结构 、生物活性、分子量大小等性质不同，选择不同的分离纯化模式。多维液相色谱法是利用两根或多根性质不同的色谱柱，通过一定的接口和切换技术对不同色谱分离模式的结合，或一根色谱柱内通过填充不同分离模式的色

18、谱填料，完成对复杂样品的待分析组分进行分离。多位液相色谱具有分离样品动态范围宽、分辨率高、分析速度快、自动化程度高等优点。近几年来，多维液相色谱分离模式在蛋白质组学和生物制药领域得到了很广泛的应用。亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。亲和色谱的显著特点：具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。所以亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。特别是对分离含量

19、极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。亲和膜色谱亲和膜色谱以膜为亲和载体，偶联亲和配基，选择性地吸收目标物质。亲和膜色谱是在亲和色谱的基础上发展起来的，是现代膜分离技术与亲和色谱技术的结合。径向色谱技术是最有效的复杂样品快速分离、制备工具之一，尤其在生物样品的制备、复杂样品的初分离等方面与传统轴向液相色谱相比具有明显的优势。该技术的发展可以追溯到60年前，1947年，Hopf发明了一种通过离心力分离液体溶液的装置，在大规模制备分离方面得到很好的应用11。1972年，Heftmann12将这种液体分离器的尺寸减小，转速增加到1950rrain，分离效率得到较大提高。

20、带有填充颗粒床的径向流离心分离器最早应用于化学反应器，后来也被收入到分析化学中。Saxena13等在美国专利“径向薄层色谱”中，对径向色谱技术的特点、操作及原理进行了阐述； Rice14等搁采用特殊设计解决了流体在床层中的分布问题，使径向色谱在上样量、分离速度等诸多方面的优势明显地表现出来，推动了径向色谱的实用化进程，真正使径向色谱走向产业化。随着生物工程技术研究的不断深入，径向色谱的应用前景非常广阔。采用径向色谱技术对蛋白质类生物大分子进行精制，不仅可以改善产品质量，提高生产效率，也可以简化生产流程，实现生产过程的连续化和自动化，将是今后一段时问色谱方法与生物技术结合的重要发展方向。4总结随

21、着生物技术成果的不断积累和生物技术产业化进程的不断推进，生物制品的分离与纯化技术已成为实现生物高技术产业化的关键，在理论和技术研究上都得到了长足的发展。发展层析柱和凝胶过滤柱的放大技术，大规模分离过程的自动控制下，游工程的集成优化技术等成为工业化生产中的关键，液相色谱是工业生产上常用的有效方法，而模拟移动床色谱和径向色谱等将在生物工程领域发挥越来越重要的作用。在研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术的同时，进行各种分离技术的高效集成化，可以达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。 在这个各学科快速发展，并相互影响的时代，生物大分子分离技术必将不断的推陈出新，以更加方便、高效、快

22、捷的方式应用于科研和生产领域。参考文献：1 苏拔贤.生物化学制备技术.北京:科学出版社，1986,5152.2 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学,北京:高等教育出版社,2002,307-313.3 汤茶琴，张定，陈暄，徐德良黎星辉，肖润林茶叶中-氨基丁酸及谷氨酸的纸电泳测定J江苏农业学报，2007，23(2)：1351384孙莉丽，李荣华醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白实验的改进J实验室科学，2010，13(2)：58-625 盖新娜，蒋辉，卢静，孙少华，王钜用SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法提纯蛋白J实验动物科学与管理,2001，18(4)：44456 邓延倬，何金兰. 高效毛细管电泳.北京科学出版社,1996,272317.7 Dirk Bandilla, Cameron D, Skinner. Protein separation by monolithic capillary electrochrom-atographyJ .Journal of Chromatography A, 2003, 1004(1-2) : 167-179.8 Wu RA, Zou HF, YeML, et al. Capillary electrochromatography for separation of peptides driven with elec