氧化亚铁硫杆菌的分离及生物学特性--论文

1、成都理工大学毕业设计氧化亚铁硫杆菌的分离及生物学特性研究作者姓名：冯雷专业：生物工程指导老师：谢鸿观摘要氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans,简称T. f)属革兰氏阴性无机化能自养菌、嗜酸、专性好氧,靠氧化基质中的Fe2 +为Fe3+和低价态硫为硫酸根而获取能量。它广泛存在于土壤海水、淡水、垃圾、硫磺泉和沉积硫内,尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水中最为常见。因此，本论文从T.f菌的分离纯化出发，进行了T. f菌的生理生化及其生物活性的研究。本文从浸矿溶液中分离得到的氧化亚铁硫杆菌进行研究，结果表明硫酸亚铁相对于硫来说是一种速效能源，单质硫是长效能源，并且能提供比亚

2、铁更高的能量。关键词：氧化亚铁硫杆菌，微生物冶金，生物浸矿，分离纯化Isolation of Thiobacillus and biological characteristicsName: Feng LeiMajor: BioengineeringSupervisor: Xie HongguanAbstractFerrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans, called T. f) ,an inorganic chemoautotroph Gram negative bacteria, acidophilus, specific aerobic, relyi

3、ng on substrate oxidation in Fe3+ and Fe2+ for the low state of sulfur to sulfuric acid roots and obtain energy，which is widely found in soil water, fresh water, waste, and deposition of sulfur in sulfur springs, especially in sulfide minerals such as acid mine water and coal the most common . There

4、fore, this paper from the T.f purification and identification of bacteria in conducting the physiological strain Af its biological activity. This separation from the leaching solution obtained ferrooxidans study results show that compared with ferrous sulfate sulfur is a kind of quick energy, sulfur

5、 is a long-lasting energy, and can provide more energy than the ferrous .Key words: Thiobacillus ferrooxidans , microbioleaehin ,Biological leaching ,isolation目 录摘要IAbstractII一、 前 言11.1生物冶金的概念11.2碲矿的生物冶金21.3氧化亚铁硫杆菌的作用31.4 本实验研究内容3二、实验部分52.1实验材料与设备52.1.1菌种采集52.1.2实验试剂52.1.3实验仪器52.1.4培养基62.2研究方法72.2.1

6、菌种富集培养72.2.2分离纯化72.2.3单层平板的制作82.2.4双层平板的制作92.2.5革兰氏染色92.2.6 pH测定92.2.7细菌计数方法92.4生物特性研究112.4.1生长曲线112.4.2氧化亚铁硫杆菌菌株对能源的利用情况112.4.3最适生长温度的测定112.4.4最适初始pH值的测定11结果与讨论12结论15致谢16参考文献1717一、 前 言矿物质是在工业生产中不可缺少的物质，是经济建设的重要物质基础。我国含有的矿产资源种类丰富，矿产已探明储量丰富。我国是一个地大物博的强大国家，但由于人口基数大，导至各种资源人均占有量低于世界平均水平。所以我国矿产资源相对紧缺，富矿多

7、数已开发利用，还有很多贫瘠矿，矿含量相对低于其它富矿，开采难度大。现有开采技术的开采方式对环境的破坏程度大，提取矿物质也不完全正确，很多矿仍不能开采。针对目前的情况，微生物浸矿是一种新的开采方式，具有溶矿率高，不污染环境等独特优势。1.1生物冶金的概念 生物冶金是利用矿物为营养基质的微生物的作用，将矿物中金属溶解，进分离、富集、纯化而提取金属的湿法冶金技术。该技术具有流程短、成本低、环境友好和低污染等特点，特别适于处理贫矿、废矿、表外矿及难采、难选、难冶矿的堆浸和就地浸出。从文献记载来看，中国是世界上最早采用生物冶金技术的国家，早在公元前六、七世纪，就在采铜、铁过程中不自觉地利用了自发生长的某

8、些自养细菌。而在欧洲，这种技术的应用至少始于公元二世纪，从1687年开始，瑞典中部Falun矿山的铜矿至少已经浸出了2百万吨铜1。在国外，铜，铀的生物提取以及含砷金矿的预氧化已实现产业化。在铜的生物提取方面，目前用生物法提取的铜约占世界总铜产量的25%，在美国、加拿大、澳大利亚、智利等20多个国家实现了生物提铜产业化。在我国，也有2座铜的生物氧化提取厂投入生产。在含砷金矿的生物预氧化方面，随着自然金开采的日益枯竭，含砷难处理金矿己成为开采对象，含砷金矿的主要矿物是黄铁矿、毒砂，金以微粒成亚显微形态包裹在硫化物中或浸染在黄铁矿、毒砂的晶格中，细磨和直接氰化法很难提取。而使用氧化亚铁硫杆菌等细菌分

9、解外部的包裹层，可使金裸露出来，有利于化学浸出，从而提高金的回收率2。目前国外至少有10个生物氧化提金厂己经筹建投产，国内也建成了2个生物预氧化黄金生产厂。在铀的生物提取方面，加拿大利用细菌浸铀的规模最大、历史最久，法国、美国、葡萄牙等国家也实现了细菌浸铀的产业化生产。目前世界范围内，生物冶金成功应用于工业化生产的主要是铜、铀和金银等,使用范围从堆浸法逐步扩展到了地浸法和原地破碎浸矿法，正在向铜、铀、锰、铅、镍、铬、钻、铁、砷、锌、铝等几乎所有硫化矿的浸出扩大。产业化相对领先的国家有智利、澳大利亚、美国、南非、日本等，中国、欧盟也从近几年先后投入大量资金开展生物冶金领域的研究。纵观全球，生物冶

10、金业化主要在三个方面，并形成两大技术3。1.2碲矿的生物冶金碲是一种稀有，但有很大利用价值的非金属资源。在地壳中的含量很少, 仅有2×10-7，其应用相当广泛，主要是用作钢铁有色金属的添加剂, 其次是石油, 化工生产的催化剂,橡胶的硫化剂、促凝剂, 且在玻璃电子工业中有独特用途。目前，碲已经成为世界战略需求资源，从军事到民用，碲都发挥着不可替代的作用。碲矿物有碲金矿（AuTe2）、辉碲铋矿(Bi2TeS2)和碲铜矿等，都很稀少。辉碲铋矿（tetradymite）是一种铋和碲的硫化物矿物，它具有的浅灰色带有金属光泽，并且还会褪色变暗。有叶、粒、块状等。辉碲铋矿是一种较难独立成矿的碲硫化

11、物。在我国四川石棉县大水沟发现的世界罕见的碲原生矿，有很大开发前景。此矿石含碲一般在1%到12%，个别高达36.6%；含铋一般在3%到20%，个别达40%以上4。由于碲矿分布相对分散，是一种低品位、难开采矿，同时统开采方式易造成资源浪费、环境污染、能源消耗过大等问题。而生物冶金正是能够解决上述困难的新发展方向12。本文所用的矿样为原矿经浮选获得的低品位碲精矿，是以辉碲铋矿为主的混合硫化矿，用单因子实验法进行不同pH条件下摇瓶浸出试验，探究生物浸出时的一系列适宜条件，以期提高碲矿的生物浸出率。图 11辉碲铋矿（tetradymite）1.3氧化亚铁硫杆菌的作用氧化亚铁硫杆菌是嗜酸性化能自养型细菌

12、, 专性好氧, 最佳生长pH值为2.02.5, 最佳生长温度2835, 能以氧化Fe2 + 、元素S及金属硫化物等来获得生命过程中所需能量, 并以O2 作为氧化过程中的最终电子受体。这类细菌很早就被应用于贵金属的浸出和回收, 适合于从低品位的矿石中浸出稀有贵金属。细菌浸出的方法由于具有成本低、能耗小、无污染等特点而获得广泛应用, 据报道美国有25%左右的铜是通过这种方法开采的5。此外在含硫废水处理和煤的脱硫、以及脱去硫化氢和二氧化硫等方面也有重要的应用前景。然而由于氧化亚铁硫杆菌的野生菌氧化Fe2 + 、元素S以及金属硫化物的速度慢, 生长条件要求苛刻, 以及对某些金属离子缺乏耐受能力等, 从

13、而限制了其应用范围。所以人们试图通过各种驯化与诱变育种的方法来提高氧化亚铁硫杆菌的适应范围和应用价值。在生物浸矿中，最常用的菌种是氧化亚铁硫杆菌。由于各地的氧化亚铁硫杆菌不一样，生长状况不一样，在各种环境中的含量也不同。所以在将其运用到工业生产中，首先要分离得到纯的氧化亚铁硫杆菌菌株。1.4 本实验研究内容通过对氧化亚铁硫杆菌的一些文献资料的分析，总结前人已有的成果，从实验室的浸矿溶液中分离出氧化亚铁硫杆菌，前对其的一些基本生物活性进行分析。调整培养基的各种理化条件，使其最适合氧化亚铁硫杆菌的生长，从而将此生产条件调节到此环境，以使氧化亚铁硫杆菌最大程度的进行生物浸矿。(1) 分离到氧化亚铁硫

14、杆菌菌株。(2) 分析氧化亚铁硫杆菌的生物学活性。 (2)本文研究内容：技术路线：二、实验部分2.1实验材料与设备2.1.1菌种采集本实验所用菌液为本实验室以前浸矿培养液。 2.1.2实验试剂蒸馏水，（NH4）2SO4(分析纯)，KCI(分析纯)，K2HPO4(分析纯)，MgSO4·7H2O(分析纯)，Ca(N03)2(分析纯)，FeSO4·7H2O (分析纯)，K 2Cr2O7(化学纯)，AgNO3(化学纯)，二苯胺磺酸钠(分析纯)，KSCN(分析纯)。2.1.3实验仪器本章实验所用到的主要仪器及其型号和生产厂家如表2一1所示: 表2一1 实验设备仪器名称型号产地电子天平

15、YJ2502上海精密科学仪器有限公司精密pH计PHS-3 C上海雷磁仪器厂台式高速离心机5804R德国汉堡EppendorfCor.空气浴振荡器HZQ-C哈尔滨市东明医疗器械厂数控恒温浴锅DK-98-1天津市泰斯特仪器有限公司电子分析天平FA1104N上海精密科学仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-S-301上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热恒温培养箱DHP一9052上海一恒科技有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG9070A上海一恒科技有限公司图2-1 部分仪器2.1.4培养基氧化亚铁硫杆菌的代表培养基是9K培养基和利森(Leathen)培养基，其组成见图2-2。图2-2 利森(Leathen)

16、和9K培养基的组成69K富集培养基配置方法:9K盐溶液: （NH4）2SO4,3.00g;KCl,0.10g; K2HPO4,0.50g;MgSO4·7H2O 0.50g; Ca(N03)2 0.01g;按此配方加蒸馏水配溶液1000mL。9K培养基:为9K盐溶液加入FeSO4·7H2O 44.6g/L。改进的9K固体培养基，该培养基由A液、B液和C液三部分组成:A液: （NH4）2SO4 1.5g;KCI 0.1g，K2HPO40.5g; MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(N03)2 0.01g，KSCN15.4g，蒸馏水200mL，121oC灭菌30min

17、;B液: FeSO4·7H2O 22g蒸馏水300mL，pH2.0，用微孔滤膜(0.22um)过滤灭菌;C液:琼脂糖10g，蒸馏水500mL，1210C灭菌20min。2.2研究方法2.2.1菌种富集培养实验中选用液体9K培养基对菌液进行富集筛选。在250mL锥形瓶加入200mL灭菌后的9K盐溶液和4.46g FeSO4·7H2O，用50%的H2SO4调到pH2.0左右，接种处于对数期生长的菌种5mL，于30、160r/min摇床中恒温震荡培养。经过三到四次传代培养，使得嗜酸氧化亚铁硫杆菌成为绝对优势菌7。培养基由浅绿色逐渐加深，最后变为棕红色，溶液混浊，且有沉淀出现。这表

18、明液体培养基中Fe2+被氧化成了Fe3+，即有细菌生长。对该菌液进行计数，发现菌浓度己达到107108个/ml。2.2.2分离纯化目前分离菌种主要采用以琼脂(或琼脂糖)作凝固剂的固体培养基进行8。本实验采用稀释涂布平板法，步骤如下:取菌液1mL，用pH=2.5的稀硫酸按每次稀释10倍，依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度的稀释液。吸取稀释度为10-4、10-5、10-6稀释样各0.2mL，分别接种到三个预先准备好的9K琼脂固体培养基，涂布均匀，正置于30恒温生化培养箱中静置培养，次日把培养皿倒置继续培养，直至固体培养基表面出现圆形凸起状小菌落(直径大约1mm

19、)，一般需要两周9。将单独小菌落挑起，每个小菌落分别接种到装有5mL9K液体培养基的小锥形瓶(或试管)中，以棉球封口，放在30摇床中进行振荡培养。这样培养出的即为单一菌的纯培养10。如此反复，直到纯化为止。操作均在无菌工作台上进行，所有器皿均经高压湿热灭菌，接种环用酒精灯灼烧消毒。图2-3 分离过程图2.2.3单层平板的制作培养基分为三部分制作：(1)9K固体培养基(Fe2+=9g/L)A液:9K无铁液体培养基42mL，pH3.0B液:1.5%琼脂溶液40mLC液:14.78%FeS04·7H20溶液18mL(2)9K固体培养基(Fe2+=4.5g/L)A液:9K无铁液体培养基42m

20、L，pH.30B液:1.5%琼脂溶液40mLC液:7.39%FeS04·7H20溶液18mL2.2.4双层平板的制作在无菌平皿中倒入已溶化并冷却至60的琼脂作底层，待平板凝固后，用无菌吸管取0.1mL处于对数期的酵母菌菌液于底层平板并放置1-2h。再分别将用于分离T.f菌的固体培养基A、B、C液3者混合，迅速倒入混匀，作上层平板，凝固后备用11。2.2.5革兰氏染色（1）用接种针挑取单个菌落，涂布于干净载玻片上的一滴无菌水中，风干（2）滴加结晶紫染色液染1-2 min，水洗，吸干；（3）用碘液冲去残水，并用碘液覆盖处理1 min，水洗，吸干；（4）用95%乙醇脱色，流滴至洗脱液无色，

21、一般2030 s；（5）用番红染液复染23 min，水洗；（6）风干后用显微镜油镜观察。2.2.6 pH测定1、溶液pH值用奥立龙818型酸度计测定。2、使用pH试纸进行测定。2.2.7细菌计数方法在测定细菌浓度时，细菌的计数方法较多，有显微镜直接测定法、平板计数法、光电比浊法、生物量测定法及DNA含量测定法等12。考虑到直观、起见，本实验在菌种性质的研究中，细菌计数采用显微镜直接计数法，这包括计数板法、涂片染色法、比例计数法等，以计数板法最为常用，但该较费时。该法是根据测定对象选用特制的载玻片(即计数板)，其上刻有己知面积的大小方格(即计数格)，当盖上盖玻片后，盖玻片与计数格间的高度为已知，

22、因此计数格的容积为一定。根据在显微镜下测得的该计数格中的微生物个数，可算出单位体积待测液中所含微生物数13。该方法操作和步骤如下：(1)备片:取清洁干燥的计数板与盖玻片(必要时，可微微烘干，以除去其上附着的水分)，盖上盖玻片。注意盖玻片要盖在计数室两侧14。(2)镜检计数室:在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。(3)加样:用无菌吸管吸取充分摇匀并打散开的待测菌液，小心滴一小滴于盖玻片边缘，菌液自行渗入并布满计数室，注意避免产生气泡。(4)显微计数:加样后静置35分钟，镜检。根据受检微生物个体大小选用适宜的物镜头，先用低倍物镜找好计数室位置，然后换用高倍物镜进

23、行计数。计数前如发现菌液过浓，可做一定倍数稀释后再制片镜检计数，一般每个小方格内有510个菌体为宜。一个计数室选5个中格(可选4个角和中央的中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。计数时注意转动细调节器，使液层上下菌数都可测到。每份菌液样品至少计数两次取其均值8。(5)清洗血球计数板:使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。(6)结果计算:一个计数室就是一个大方格，分为25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，所以每个计数室中的小方

24、格数都是16X25=400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个计数室的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25，就得出一个计数室中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个计数室的总菌数（即0.1mm3中的总菌数）为（A/5）*25*B；因此1mL=1000mm3，故1mL菌液中的总菌数=（A/5）*25*B*10*1000=50000A*B个。2.4生物特性研究2.4.1生长曲线将预先培养好的细菌分别接

25、种于亚铁和元素硫的培养基中(接种终浓度为1·0×106个/mL),在2560或30及pH 1·05·0的条件下摇床培养,2天后每隔48 h取样,用血小板计数法测定细菌的数量15。2.4.2氧化亚铁硫杆菌菌株对能源的利用情况在100 mL基本盐培养基中分别加入1 g除菌的单质硫或4·31 g FeSO4·7H2O和1 g单质硫的混合物、硫代硫酸钠、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、黄铁矿和铁闪锌矿,分别配成含硫或亚铁和硫、硫代硫酸钠、不同碳源、不同矿样的特别基质.然后,按2.4.1方法接种,在30条件下分别培养5天后,观察细菌的生长情况.2.4.

26、3最适生长温度的测定将相同数量的氧化亚铁硫杆菌株接种到多份9 K葡萄糖液体培养基中，分别置于不同温度条件下，经170 r/min振荡培养，第72 h时，在显微镜下直接计数，确定不同温度下菌株的生长情况16。2.4.4最适初始pH值的测定将相同数量的氧化亚铁硫杆菌株接种到不同初始pH值的9K葡萄糖液体培养基中，经30、170 r/min振荡培养，第72 h时于显微镜下直接计数，确定不同pH条件下细菌的生长情况。结果与讨论通过本次实验，综合各项数据，进行分析：1、菌种来源：本实验采用实验室原有的浸矿溶液对研究者与使用者来说，工业微生物即浸矿菌种的获得一般有两种方法：（1）从微生物保存单位直接购买。

27、这样可以节省时间，并减少工作量，但这样获得的菌种常常没有从自然界采集的野生菌适应性强12。（2）直接从自然界中采集野生菌。这种细菌适应性强，故人们常常从自然界中采集。2、细菌形态结构革兰氏染色，观察细菌形态。菌体形态特征：该菌在固体培养基上培养时,培养基的颜色由最初的浅绿色变为黄绿色,约10天左右在培养皿上长出小菌落,该菌落为黄褐色、圆形,直径约0. 50. 8mm,中部突起,被水合高铁包裹,质地坚硬,较难挑起17。在显微镜下该菌为短杆状,两端钝圆,以单个、双个或几个呈短链状存在,能运动,革兰氏染色阴性。图2-4 细菌显微结构3、9K固体培养基制作固体培养基本可由液体培养基中加入一定比例的琼脂

28、直接制成，但因琼脂在酸性环境中易于水解，在本实验中只有将培养基与琼脂分开灭菌后混合制平板。A、B液121湿热灭菌15min，C经0.22um微孔滤膜过滤除菌，待A、B液冷却到60与C液混合后倒平板，待平板冷却凝固后即可进行菌液的涂布。4、营养类型：化能自养菌在富集培养的实验中,随着菌体的生长, 9K液体培养基的颜色由浅绿色依次变为土黄色和红棕色,这是由于溶液中Fe2+被氧化成Fe3+,最终有淡黄色黄钾铁矾沉淀生成;实验还表明该菌能利用亚铁和单质硫生长,但在蛋白胨培养基中不能生长,所以该菌属专性化能自养菌。这些实验结果表明该菌具有氧化亚铁硫杆菌的特性。5、生长曲线生物氧化过程中Fe2+浓度以及细

29、胞数目随时间变化如图，T.f生长进入稳定期，细菌浓度达到最大值1.3x107个/mL。稳定期可以持续到第7d，然后进入衰亡期18。与对照相比，接种处理的培养液中Fe2+氧化主要发生在延滞期间，两天后Fe2+基本耗尽。图 2-4 氧化亚铁菌菌株的生长曲线6能源利用情况图2-5为氧化亚铁菌菌株亚铁培养基和硫培养基中的典型生长曲线.由图2可知,培养早期细菌在亚铁培养基中的增长速度明显比在硫培养基中的快,但100 h后,在硫培养基中的细菌浓度明显高于在亚铁培养基中的细菌浓度,细菌浓度达到108个/mL.细菌在利用元素硫时,需要经过一段时间诱导自身表达或合成分泌性疏水胞外物质,以利于与元素硫接触,因而在

30、开始阶段细菌的浓度较低.但一旦接触好后,硫氧化比亚铁氧化可提供更多的能量,所以培养后期细菌的浓度较高。图 2-5 氧化亚铁菌菌株在亚铁和硫培养基中的生长曲线结论本次实验，通过将氧化亚铁硫杆菌菌液进行倒平板，采用划线分离法，得到氧化亚铁菌株，再进行生物特性的研究，得出以下结论：（1）从实验室样品中分离纯化得到细菌菌株，观察：固体培养10天后出现菌落，均为黄褐色，圆形，直径1mm，中部突出，质地坚硬。可以利用亚铁和单质硫作为能源。（2）T.ferrooxidans菌在亚铁培养基中迟缓时间短，比生长速率高，倍增时间短，说明硫酸亚铁相对于单质硫是一种速效能源。(3)在硫培养基中T.ferrooxida

31、ns菌出现二次，甚至更多次的对数生长，最终细菌浓度远远高于亚铁培养基中的细菌浓度，说明单质硫是一种长效能源，能提供比亚铁更高的能量。(4)对最佳生长条件的研究表明,在初始pH 值为22. 5 ,温度在3035 范围内,初始Fe2+度为9 g/ L ,接种量为10 %时,菌株既能维持良好的生长,又能对Fe2+的氧化速率保持较高水平。下一步将通过传统诱变技术和现代基因工程手段改良该菌株,使其满足工业化生产的需求。致谢经过半年的忙碌和工作，本次毕业设计已经接近尾声，作为一个本科生,在完成毕业设计过程中，由于经验的匮乏，难免有许多考虑不周全的地方，如果没有导师的督促指导，以及一起工作的同学们的支持，想

32、要完成这个设计是难以想象的。在这里首先要感谢我的导师谢鸿观老师。谢老师平日里工作繁多，但在我做毕业设计的每个阶段，从查阅资料，设计草案的确定和修改，中期检查，后期数据分析等整个过程中都给予了我悉心的指导。除了敬佩谢老师的专业水平外，他的治学严谨和科学研究的精神也是我永远学习的榜样，并将积极影响我今后的学习和工作。其次要感谢生物工程办公室雷泞菲、童晋等老师在实验室的细心指导和李先锋、何超等同学们在做实验过程中对我的帮助，他们在本次设计中都给了我很大的帮助。另外，在完成实验及本论文的撰写过程中，还得到了很多其他老师和同学的关心与帮助。感谢生物工程专业所有老师授予我的专业知识，才使我有能力完成毕业设计。感谢我的室友们在此次毕业论文的完成中给予我的帮助，才能使我顺利的完成毕业论文。在此我对帮助、关心、支持我的老师和同学表示最诚挚的谢意。最后，特别感谢关爱我的父母，没有他们一直以来的无私支持和鼓励，本论文无法顺利完成，是他们一直默默的给予我无限的精神支持与勇气。再次表达我对所有帮助我、关心我的人的最诚挚的谢意！参考文献 1Bower Eva, Milne Annabel. Finnie's Handling the Young Child with Cereb