非小细胞肺癌多药耐药性病理学检测的临床意义

1、非小细胞肺癌多药耐药性病理学检测的临床意义【摘要】目的检测113例非小细胞肺癌(nsclc )中谷胱甘肽疏基转移酶n (gst 兀)、肺耐药相关蛋白(lrp)、dna拓扑异构酶ii a ( topo ii a )、多药耐药相关 蛋白(mrp)和多药耐药基因(mdr1 )的表达，观察上述指标与肿瘤临床病理因素 的关系及各指标表达之间的相关性。方法采用免疫组化sp法检测gst tt、lrp、 topo ii a蛋白的表达;应用原位杂交技术检测mrp和mdr1 mrna表达。结果(1) gst 冗、lrp、topo ii a蛋白及mrp、mdr1 mrna在113例nsclc中的阳性表达率分 别为

2、75. 2%. 80. 5%. 60. 2%. 79. 6%. 51.3%。其中 lrp 表达最高,mdr1 表达最低。 (2)lrp、topo ii a和mrp的表达分别与肿瘤组织学类型有关。(3)gst 兀与mrp (pv0.05)、lrp 与 mrp (p<0. 01 ). mdr1 与 mrp (p<0. 01 )的表达间具有相关 性。结论(1)多种耐药相关基因的过度表达及其相互作用可能是nsclc产生原发 mdr的重要原因。(2)lrp和mrp过度表达，topo ii a高表达和mrp低表达可能分 别与肺腺癌、鳞癌的化疗敏感性有关。【关键词】非小细胞肺癌；多药耐药；免疫组

3、化；原位杂交abstract: objective to evaluate the expressions of gst n, lrp, topo ii a, mrpandmdrl in 113 non smal 1 cel 1 lung cancer (nsclc), to observe their relat ionships wi th cl inicopathologic character ization of cancer and their interactions. methods expressions of gst tt , lrp and topo ii a were

4、detected by s p immunohistochemistry, and expressions of mrp, mdr1 mrna in paraffin embedded cancer tissues were detected by in situ hybridization. results (l)the positive rates of gst tt , lrp, topo ii a and mrp, mdr1 mrna were 75. 2%, 80. 5%, 60.2%, 79. 6% and 51. 3% in nsclc, respectively. (2)the

5、 expressions of lrp, topo ii a, mrp had a close relationship with the histological types in nsclc, respectively. (3)there were significant relationships between positive rates of gstn andmrp (p < 0. 05), lrp and mrp (p < 0. 01), mdr1 and mrp (p < 0. 01), respect ively. conclusion (1)the ove

6、rexpressions and interact ions of gst , lrp, topo ii a, mrp and mdr1 are important causes of primary mdr in nsclc. (2)the overexpressions of lrp and mrp, the overexpression of topo ii a and the reduced expression of mrp, which are related with the chemotherapeutic sensitivity in adenocarcinoma and s

7、quamous carcinoma, respect ively.key words: non small cell lung cancer; multidrug resistance; immunohistochemisty; in situ hybridizationo引言多药耐药是指肿瘤对一种化疗药物出现耐药的同时，对其他许多结构不同、作用 机制各异的化疗药物亦产生交叉耐药的现象。与小细胞肺癌相比，非小细胞肺癌（nsclc ）的联合化疗有效率较低，其耐药性更为突出。本研究采用免疫组化和原 位杂交技术，对nsclc组织中5种多药耐药相关蛋白或mrna的表达进行检测，试 图深入了解nsclc

8、的多药耐药状况、相互关系及不同耐药机制，为nsclc病例制 定合理的化疗方案提供理论依据。1资料和方法1.1病例来源收集武汉大学中南医院病理科1996 - 2000年5年间存档并经病理确诊的 nsclc手术切除病例共113例。所有病例术前均未经放、化疗，其中男91例，女 22例；年龄34 - 77岁，均龄57岁；鳞癌39例，腺癌（含细支气管肺泡癌）61 例，腺鳞癌13例；高分化癌43例，中分化癌47例，低分化癌23例。113例中， 淋巴结送检者共90例（有淋巴结转移者37例，无淋巴结转移者53例），23例无 淋巴结送检记录；按tnm分期，i期52例，ii期26例，iii期11例，iv期1例,

9、23例无记录。标本均经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片厚45m m。1.2实验方法1.2.1切片制作标本均经10%中性formalin液固定，常规脱水，石蜡包埋，4ym厚切片。每例 切片6张。1张he染色，用于肿瘤常规病理诊断及分类。3张免疫组化染色，用 于观察肿瘤中gst tt、lrp及topoiia蛋白表达；2张原位杂交，用于检测肿瘤 中mrp和mdr1 mrna表达。1.2.2免疫组化染色及原位杂交采用免疫组化sp法。所用鼠抗人gst兀、lrp及top。ii a单克隆抗体分别购 于福州迈新生物技术公司、上海仪涛生物仪器有限公司，均为即用型。以已知阳 性切片作阳性对照，pbs取

10、代一抗作阴性对照。原位杂交所用地高辛标记mdr1.mrp寡核甘酸探针及检测试剂盒购于武汉博士德 生物工程有限公司。检测方法按试剂盒说明书进行。用已知阳性片作阳性对照， 以预杂交液代替一抗作阴性对照。1. 2. 3结果判断除topo ii a蛋白阳性表达为细胞核着棕黄色外，gst 兀、lrp蛋白、mrp和mdr1 mrna阳性表达均为胞浆呈棕黄色颗粒。每例随机取10个高倍视野（x 400 ）,计 数其阳性细胞百分率。阳性细胞率5%定为阳性，5%视为阴性1。1.2.4统计学处理采用spss 11. 5统计软件，以双向无序r x c表的x 2检验及fisher精确检验作 指标间的差异和相关性分析。p

11、<0. 05为显著性检验标准。2结果2. 1 5种多药耐药相关蛋白或mrna在nsclc中的表达(dlrp蛋白在nsclc中的阳性表达率最高，见图1 5。mdr1 mrna表达率最低； lrp、topo ii a蛋白和mrp mrna表达与nsclc组织学类型有关。lrp蛋白的表达 为腺癌腺鳞癌鳞癌，其在腺癌中的表达明显高于腺鳞癌、鳞癌(p<0. 05); topo ii a蛋白在鳞癌中表达最高，明显高于腺癌和腺鳞癌(pc0.05); mrp mrna 在鳞癌中的表达明显低于腺鳞癌和腺癌(p<0. 05);上述5种多药耐药相关蛋 白或mrna的表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移

12、状态及临床分期均无相关性(p >0. 05),见表1。表1 113例nsclc中5种多药耐药相关蛋白或mrna的表达(略)2.2 5种多药耐药相关蛋白或mrna表达间的相关性统计学分析表明，gst 兀蛋白与mrp mrna (p<0. 05). lrp蛋白与mrp mrna (p<0. 01)、mdr1 mrna与mrp mrna (p < 0. 01 )表达间均具有正相关关系。其余 多药耐药蛋白或mrna表达间无相关性。3讨论多药耐药基因mdr1属于人类mdr基因家族。p糖蛋白(p gp)为mdr1基因的 编码产物，mdr1基因可导致其过量表达。p gp定位于胞膜和内

13、质网周边，是一 种跨膜蛋白质，可将进入癌细胞内的抗癌药物泵出癌细胞并导致癌细胞耐药2。 mdr1几乎在所有肿瘤类型中都有表达，但其表达水平与肺癌耐药性和预后的关系 尚一直存在争议。多数学者认为mdr1与肺癌多药耐药无关，甚至有学者提出mdr1 mrna和蛋白表达与nsclc化疗敏感性或细胞内/核内顺钳的蓄积无关的观点3。 尚有学者认为二者间存在明显的关系4。本研究中mdr1在未经治疗的nsclc 中的阳性表达率为51.3%,表明其可能是导致肿瘤多药耐药的因素之一；但mdr1 在本研究5种多药耐药相关蛋白或mrna中表达率最低，且其表达与临床病理因素 均无关，说明mdr1与nsclc生物学表型的

14、关系尚需进一步研究。大量研究表明，mrp基因表达是nsclc原发多药耐药的重要参与因素，尤其参与 肿瘤对长春新碱、依托泊武和阿霉素等药物原发性耐药的形成过程5。本组113 例nsclc中，mrp阳性表达率为79. 6%,提示nsclc具有与mrp基因相关的原发性 耐药，且其表达与肿瘤组织学类型有关，在肺鳞癌中的阳性表达率分别明显低于 腺鳞癌和腺癌(p<005),这与wright等6的报道基本一致。最近double等7 提出mrp1在dna异倍体细胞中的阳性细胞百分率显著高于dna二倍体细胞，认为 其表达可用于预测肿瘤对化疗的反应性，主张对dna异倍体肿瘤应采用不同于二 倍体肿瘤的治疗方法

15、。1998年ikeda等8发现lrp在14个肺癌细胞系中均呈阳性表达，且其mrna 水平与多种抗肿瘤药物的交叉耐药有关。berger等9观察了 16个nsclc细胞 系中lrp的表达，发现每个细胞系均有不同水平lrp表达，且与顺钳的耐药明显 相关。在培养基中加入柔红霉素与博来霉素后，有一半细胞中lrp表达显著升高。 上述研究表明lrp在nsclc中表达频率非常高，与肿瘤内在性和获得性mdr均有 密切关系。在本研究观察的5种多药耐药相关蛋白或mrna表达中，lrp表达水平 最高(80. 5%),尤其在肺腺癌中的表达分别明显高于腺鳞癌和鳞癌。我们的观察 结果不仅与文献报道相符，而且进一步说明lrp

16、是导致nsclc多药耐药的主要原 因10。一般认为，gst冗在不少肿瘤中均有明显的基因扩增及表达水平增高，是目前 认为与肿瘤耐药关系最为密切的一种gst。nakanishi等11用免疫组化法观察 54例未经治疗的nsclc,结果gst兀阳性表达率为69%,但其阳性表达组和阴 性表达组的化疗反应率却分别为16%和47%。最近unsal等12提出，gst 兀的表达并不总能预测nsclc对含有顺铀的联合化疗药物的反应性。本组nsclc 病例中，gst兀阳性表达率为75.2%,但其表达与各临床病理因素间均无相关性。 因此，gst兀在nsclc中的表达意义尚需继续深入探讨。topo ii a是一种能催化

17、dna超螺旋结构局部构型改变的基因核酸，尤其是topo ii a是肿瘤化疗的重要靶点。目前应用的topo ii抑制剂是通过形成药物-酶-dna 复合物干扰酶的活性，从而影响肿瘤细胞dna代谢而发挥其细胞毒作用，而肿瘤 细胞对topo ii抑制剂的敏感性则主要取决于细胞内topo ii的水平。kreisholt等 发现，在未经治疗的nsclc中，topo ila表达明显低于sclc的表达，说明topo ila数量减少和/或活性降低与肿瘤的耐药明显相关，也是nsclc原发耐药形成因 素之一 13。本组nsclc中，topo ii a的阳性表达率为60. 2%,提示其也是肿瘤 原发耐药的形成因素之一

18、。topo ii a在本组肺鳞癌中的阳性表达率明显高于腺癌 和腺鳞癌(p<005),与肺鳞癌对化疗药物较敏感的临床实际相符合。在nsclc 的化疗中，有计划地对topo ii a高表达的肺鳞癌应用topo ii抑制剂可能会取得更 好的疗效。本研究结果表明，gst 兀与mrp、lrp与mrp、mdr1与mrp在nsclc表达间存 在明显或显著相关性，表明nsclc原发mdr的形成是一个多因素、多步骤的复杂 过程，其中包括多种耐药相关基因的参与及相互协同作用。因此，深入研究肿瘤 mdr现象及其机制，对制定有针对性个体化治疗方案，提高nsclc患者的化疗效 果具有重要意义。(本文图见第164页)【参考文献】1余少平，熊永炎，田素芳非小细胞肺癌多药耐药及其神经内分泌分化 的相关性研究j中华结核和呼吸杂志，2003, 26 ( 3 ): 165168.2 huang x, li l, guo z, et al immunoelectron microscopic analysis of p glycoprotein, p53, and bel 2 protein expressions