PCR体系学习教案

1、会计学1PCR体系体系(tx)第一页，共7页。模板：单链或双链DNA引物：1对长16-30bp的寡核苷酸(决定扩增产物特异性的关键)DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶(常用Taq酶或Pfu酶)底物：四种脱氧三磷酸核苷dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTPMg2+： DNA聚合酶的激活剂PCR反应体系的五要素：反应体系的五要素：第1页/共7页第二页，共7页。3组分组分终浓度终浓度10PCR buffer1MgCl21-4mM （常用（常用1.5mM）dNTP0.2mM each（200uM each）Primer F0.1-1.0uMPrimer R0.1-1.0uMTemplate

2、DNA0.01-10ngTaq (Pfu)0.2-1UddH2OUp to final volumeTotal volume15-50uL某些公司生产的某些公司生产的buffer会预先含有会预先含有Mg离子，因此不必离子，因此不必(bb)额外再添加额外再添加Mg离子离子。第2页/共7页第三页，共7页。4缓冲液缓冲液(buffer)：提供：提供(tgng)合适的合适的pH值和值和DNA聚合酶的激活聚合酶的激活剂剂10mM TrisHCl （ pH8.3-9.0），），1.5mM MgCl2，50mM K+多次冻融会使多次冻融会使dNTP 降解。如其中任何一种浓度不同于其它降解。如其中任何一种浓度

3、不同于其它(qt)几种时几种时(偏高或偏低偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。产物的产量。Mg2+浓度浓度(nngd)过高，反应特异性降低过高，反应特异性降低,出现非特异扩增，浓度出现非特异扩增，浓度(nngd)过低会降低过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性聚合酶的活性,使反应产物减少。使反应产物减少。dNTP（底物）：等摩尔浓度的（底物）：等摩尔浓度的 4 种种 dNTP（即即 dATP、 dTTP、dCTP和和dGTP），），终浓度一般为终浓度一般为 0.2mM（即饱和浓度），（即饱和浓度）， dNTP 的的浓度会影响扩增的产量

4、、特异性和保真度。浓度会影响扩增的产量、特异性和保真度。第3页/共7页第四页，共7页。上游(shngyu)引物下游(xiyu)引物注：当双链解开成单链后，引物总是结合于靶序列的注：当双链解开成单链后，引物总是结合于靶序列的3端。端。5第4页/共7页第五页，共7页。6目前有两种目前有两种Taq DNA 聚合酶供应聚合酶供应(gngyng),一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的催化一典型的PCR 反应约需酶量反应约需酶量2.5U(指总反应体积为指总反应体积为100ul 时时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。DNA聚合酶：聚合酶： 最常用的是最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度聚合酶，最适反应温度75。 Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有聚合酶：是目前使用最广泛的具有(jyu) 3-5 外切酶活性外切酶活性（高保真）的（高保真）的 PCR 酶，目前为止错配率最