MALDITOFMS在细菌耐药性分析中的临床应用

1、1 / 20 maldi-tof ms 在细菌耐药性分析中的临床应用maldi-tof ms 在细菌耐药性分析中的临床应用maldi-tof ms 在细菌耐药性分析中的临床应用杨 峰，陈飞，赵 虎 （复旦大学附属华东医院检验科，上海200040 ）摘要：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（maldi-tof ms）具有快速、高通量、高准确性和低成本等特点，为临床微生物的鉴定带来了革命性的变化，也给细菌耐药性分析提供了一条新思路。常规细菌耐药性检测方法有纸片法、稀释法、 e-test 等，这些方法均需要长时间的培养，不能满足临床对快速药物敏感性指导的需求。maldi-tof ms 用于细菌耐药性的

2、检测具有巨大的应用价值与前景。已有一些关于maldi-tof ms 在细菌耐药性检测的实验和临床应用的报道。文章就近年来maldi-tof ms 在细菌耐药性分析相关的病原体种类、检测方法和检测效果等方面作一综述。关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；细菌；耐药性目前，细菌耐药性仍呈增强趋势，多重耐药和泛耐药菌株在某些地区的流行播散对人们的健康构成严重威胁1-3 。临床上对常用抗真菌药耐药的菌株也明显增多，给临床抗真菌治疗带来了很大的挑战4-5 。而临床常用的体外药物敏感性试验其检测周期往往在24 h 以上，不利于及时指导临床合理用药。所以临床对高效、快速的细菌和真菌体外药物敏感性检2 /

3、 20 测的新技术、新方法的需求越来越强烈。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of fight mass spectrometry， maldi-tof ms）于 20 世纪 90 年代末开始成功用于细菌和真菌的鉴定，由于其检测效率高、准确性好、成本低而被广泛应用于病原体的快速鉴定 6。近年来， maldi-tof ms 对细菌、真菌耐药性的检测潜力也逐步被发掘，它的应用加快了对细菌和真菌耐药性检测与分型的速度，其具有很大的应用前景。1 maldi-tof ms 检测细菌和真菌耐药性的原理mald

4、i-tof ms 检测细菌和真菌耐药性的原理主要有以下几方面：（1）耐药机制为产生耐药酶的菌株，其产生的酶能够水解相应的抗菌药物，抗菌药物水解前后会产生稳定的相对分子质量变化。把样本菌株接种于添加了特定抗菌药物的培养基中培养，如果菌株能够产生相应的酶，就会水解该抗菌药物，抗菌药物水解前后相对分子质量的变化会引起maldi-tof ms检测得到的图谱对应峰值发生改变，通过对其进行分析就可以对是否存在相应酶作出判断，据此间接判断菌株的耐药性7。 （2）maldi-tof ms 检测耐药菌株所得到图谱与敏感菌株相比，会出现特定峰值强度的改变、峰值坐标位置的移动和峰值的缺失或增加，利用软件对足够数量耐

5、药菌株的图谱进行分析，可以构建出专门针对该耐药菌株的图谱数据库。将 maldi-tof ms 检测样本菌株得到的图谱与该数据库3 / 20 比对，就可以对其进行耐药性判断或进一步区分耐药菌株亚种8-9 。 （3）将样本菌株置含不同浓度抗菌药物（一般包含 3 个浓度梯度： 1 个高浓度、 1 个中间浓度和1 个无抗菌药物）的培养基中培养，菌株是否具有耐药性与其生长情况有很强的相关性， 培养一段时间后，采用 maldi-tof ms 检测各菌株，分析菌株在各个不同浓度抗菌药物中的蛋白指纹图谱得到各自综合相关指数（composite correlation index，cci） ，通过计算和比较可以

6、判断样本菌株是否对该抗菌药物耐药 10-11 。 2 - 内酰胺酶检测maldi-tof ms 可以作为一种检测 - 内酰胺酶活性的工具。许多病原菌能够产生 -内酰胺酶， 水解青霉素类和头孢菌素类抗菌药物结构中的 -内酰胺环而使抗菌药物失去抗菌活性12 。水解后的 - 内酰胺环与水解前相比发生了相对分子质量的变化，并且各种抗菌药物在未水解和水解后的相对分子质量是可以确定的，由此在 maldi-tof ms 检测所得到的图谱中也会有相对应峰值的变化，不产生 -内酰胺酶的菌株则检测不出这种改变，从而判断 - 内酰胺酶活性的有无和菌株耐药性的产生与否7，13-16 。由于这种方法的检测基础是酶活性的

7、变化，所以与传统基于微生物在抗菌药物暴露下的生长代谢的耐药性检测方法相比所需时间短很多。另外，可以在培养基中加入对待测菌株有针对性的抗菌药物或离子锌以促进酶活性的表现，能够缩短实验结果的出现时间17 。有研究已经将4 / 20 这种检测方法应用于分析多种抗菌药物（青霉素、 氨苄西林、头孢菌素类和碳青霉烯类抗菌药物等），不同抗菌药物的对应图谱有不同的峰值变化，研究者的实验结果均显示，malditof ms 通过检测酶活性判断耐药性有良好的检验效能7。 但在另一项研究中，法国的研究者mirande 等18提出，虽然利用 maldi-tof ms 可以定性判断抗菌药物的水解，但是到目前为止的研究都采

8、取了不同的方案和不同的孵育时间，并没有简单、规范化的方案可以被广泛应用，而且病原菌对各种抗菌药物的耐药性的产生是一个复杂的过程，仅仅分析图谱中个别的峰值特征不足以描述其耐药性。此外，这种方法需要由有质谱专业知识的人员来分析、操作，不便于广泛开展，而且对一些具有双重耐药机制的病原菌缺乏鉴别能力，与目前微生物实验室使用的carba np 试验检测方法相比并没有很大的优势13，19。 总之， maldi-tof ms 是一种检测 - 内酰胺酶的快速、可靠的方法，在实验条件下可以对结果进行定性判断。但是其推广应用还需要有标准化的检测方案和便于自动解读的程序。3 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methici

9、llinresistant staphylococcus aureus，mrsa）的检测mrsa 在我国是引起医院感染的主要病原菌之一 20 ，mrsa 致病力强而且治疗效果差，对其进行快速准确的鉴别和分型对于临床的感染控制和合理用药以及流行病学调查有着重要意义。常用的 mrsa 分型方法是以基因5 / 20 序列为基础的分子生物学方法：脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，pfge ）分型、重复性基因外回文序列聚合酶链反应（polymerase chain reaction，pcr）分型、多位点序列分型 （multilocus sequence t

10、yping ，mlst） 、葡萄球菌a 蛋白（ staphylococcal protein a，spa）分型和葡萄球菌染色体mec 盒（ staphylococcal cassette chromosomemec ， sccmec） 分型等 21。 这些方法均对mrsa亚型有良好的鉴定和区分能力21-22 。但它们操作复杂、时间长且成本较高， 所以一些研究者尝试通过分析maldi-tof ms 检测 mrsa 所产生的图谱来进行分型。josten等23分析了利用maldi-tof ms 得到的 401 株 mrsa 和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitivest

11、aphylococcus aureus，mssa）的图谱， 分析不同的突变体和基因型的峰值变化，并结合测序方法证实了可以作为鉴别信号的峰值，他们发现，这些有意义的信号峰与菌体所具有的一些表达稳定的管家蛋白、 核糖体蛋白、 应激蛋白和小分子毒素是一致的，并且不同的蛋白峰还可用于mrsa 亚型的区分。 在另一项研究中， camoez 等8评价了 maldi-tof ms 对主要 mrsa克隆型（ clonal complex ， cc）的区分能力。他们对来自4个 cc（cc5、cc8、cc22、cc398）的 82 株 mrsa 进行分析，发现 maldi-tof ms 鉴别的敏感性和特异性分别为

12、100.00% 和 99.11% ，质荷比在 3 2786 592 之间的 11 个峰值6 / 20 具有很强的特异性，可以用来区分4 个 cc。丹麦的o/stergaard 等24进一步验证了maldi-tof ms 可以作为一种快速、简便的方法对mrsa 进行分型。该研究共纳入600 株 mrsa，包含 89 个 spa 型、 16 个 cc，鉴定出了43个有意义的蛋白峰，他们根据这些峰值将菌株分为26 个maldi-tof 组， 发现这些组与mrsa 的 spa 型和 cc 有很强的相关性。在另一项研究中，日本的ueda 等25 报告了malditof ms 对 mrsa 的鉴定分型能力

13、。 研究者获得57 株mrsa 和 1 株金黄色葡萄球菌标准菌株（atcc 29213）的质谱，并对这些菌株进行了噬菌体开放阅读框分型（phage-open-reading frame typing，pot）和 pfge分型。根据得到的质谱图提取出67 个与 mrsa 分型鉴定相关的峰值，通过对这些峰值的聚类分析验证其对mrsa 分型的可行性，结果显示利用质谱分型与pot 和 pfge分型结论一致。我国的研究者zhang 等26采用 maldi-tof ms 联合clinprotools 软件对 mrsa 的分型效能进行了研究，他们对154 株 mrsa-st239 、72 株 mrsa-st

14、5、30 株 mrsast59、14株 mrsa-st45 和 20 株其他 cc的 mrsa进行了质谱分析，结果显示，利用maldi-tof ms 建立模型，并确认对st45和 st239 鉴别的敏感性分别为100.00%、100.00%，特异性分别为 95.80% 、94.62% ，biotyper 分型对 st239、st59、st45鉴别的敏感性和特异性均超过90% ，但对 st5鉴别的敏感性7 / 20 只有 81.94% 。另外，在对特异峰值的分析中，质荷比为 4 808和 9 614 处的蛋白峰对st45 区分的敏感性和特异性均达到了 100.00%，质荷比为6 554 处的蛋白

15、峰对st239 区分的敏感性和特异性分别达到了91.90% 和 85.40% 。 综上所述，以基因序列为基础的分型方法对mrsa的分型具有很高的准确性，但是因为其复杂的程序而不能快速得出结果，并且由于其昂贵的成本也难以被广泛应用。maldi-tof ms 对 mrsa的鉴定、分型的准确性强，可重复性好，并且程序简单、成本较低，其作为一种新的mrsa 鉴定、分型工具应用于临床微生物实验室具有巨大潜力。4 耐万古霉素的肠球菌（vancomycin-resistant enterococcus，vre）检测vre因其耐药谱广、感染者住院时间长、花费大、致死率高而受到广泛关注 27 。vre主要有 v

16、ana、vanb、vanc 和 vand4 种基因型，在我国，引起临床上暴发感染的vre大多数属于vana型，主要见于屎肠球菌和粪肠球菌。一些研究者尝试使用maldi-tof ms 分析耐药菌株中由耐药基因所编码的特异蛋白来鉴定 vre。 日本的 nakano 等9利用 maldi-tof ms来区分 vana 基因阳性的屎肠球菌和vana 基因阴性的屎肠球菌。 他们选择了 61 株 vana 基因阳性的屎肠球菌和71 株 vana基因阴性的屎肠球菌，采用pcr测定 vana 基因来确认阳性菌株。借助 clinprotools 软件分析 maldi-tof ms 得到的图谱数据， 3 种 cl

17、inprotools 模型（ ga、snn、qc）的鉴别能8 / 20 力均 90% ，通过交叉验证，他们的研究结果也90% ，其中基因算法模型的鉴定效能最好，其敏感性和特异性（等同于交叉验证结果）分别为99.18% 和 92.40% 。在更早进行的另一项研究中，澳大利亚的griffin等28也在试验中用maldi-tof ms 进行 vre的鉴定。他们分析了vre的蛋白指纹图谱特征，利用分析结果能够从样本菌株中快速、准确地对 vanb 基因阳性屎肠球菌进行鉴定。研究者收集了2009 年1月 2010 年 6月得到的 67 株 vanb基因阳性屎肠球菌样本，并用 pcr金标法确认vanb 基因

18、， 最终 maldi-tof ms 准确鉴定出 66 株（ 98.5% ）样本。并且，他们对clinprotools 所产生的 svm 鉴定模型进行了3 次内部验证，得到结果为平均 92.4%的敏感性和85.2% 的特异性。这些研究结果显示，在试验中 maldi-tof ms 鉴别 vre有很高的准确性，但由于没有更多的研究结果被报道，所以不能确定这些试验的可重复性，可能研究者所得到的结果只代表了研究者当地的流行病学状况，不能确定其可以进行更大范围的应用。5 脆弱拟杆菌耐药性检测脆弱拟杆菌是厌氧菌感染中最常见的条件致病菌，其可以对多种抗菌药物耐药。利用分子生物学的方法对耐药的脆弱拟杆菌进行分析

19、，发现耐药脆弱拟杆菌dna 中多含有 cfia 基因，其可以编码一种金属 - 内酰胺酶，这种酶可以水解多种 - 内酰胺类抗菌药物， 使这类脆弱拟杆菌对多种抗菌药物耐药29 。一些研究者的研究结果表明，9 / 20 可以通过分析maldi-tof ms 的图谱来区分菌株是否为耐药脆弱拟杆菌。 fenyvesi等30 利用 maldi-tof ms ，通过已经构造完成的cfia 基因阳性 /阴性菌株的质谱文件，鉴定出了 60 株脆弱拟杆菌中的5 株 cfia 基因阳性菌株。在另一项研究中， johansson 等29 通过分析 maldi-tof ms 检测 26 个阳性血培养瓶中脆弱拟杆菌得到的

20、图谱特征来区分cfia 基因阳性和阴性的菌株，以此作为判断耐药性的依据，再用 maldi-tof ms 检测碳青霉稀类抗菌药物被水解情况，从而验证脆弱拟杆菌是否产生了耐药酶，结果显示可以把maldi-tof ms 作为对阳性血培养瓶中脆弱拟杆菌的耐药性检测工具，并且整个操作过程可以在3 h 内完成，极大地缩短了试验时间。在这些对脆弱拟杆菌耐药性检测的试验中有一个关键问题就是对耐药/敏感脆弱拟杆菌标准图谱库的构建和相应软件的完善。随着这些问题的解决，malditof ms将有可能应用于快速检测脆弱拟杆菌的耐药性。6 肺炎克雷伯菌耐药性检测对碳青霉稀类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯菌是导致医院感染的重要

21、病原菌，其对大多数 - 内酰胺类抗菌药物敏感性降低或耐药，给临床诊治带来了很大挑战31。有研究者尝试使用maldi-tof ms 对耐碳青霉烯类抗菌药物的肺炎克雷伯菌做早期诊断。ompk35 和 ompk36是肺炎克雷伯菌2 种重要的外膜孔蛋白，它们的消失或数量改变是肺炎克雷伯菌产生耐药性的机制之一。有研究发现，10 / 20 对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯菌外膜ompk35和 ompk36 减少，对这二者进行分析可以判断肺炎克雷伯菌的耐药情况 32 。但是现在常用的孔蛋白分析方法如十二磺基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyaerylam

22、ide gel electrophoresis，sds-page）比较费时，难以在常规的临床微生物实验室开展，不能被推广应用。在一项试验中，研究者以sds-page 结果为金标准，用maldi-tof ms 对 13 株肺炎克雷伯菌表面孔蛋白进行分析，结果显示 maldi-tof ms 准确判定了孔蛋白ompk36 的数量减少或缺失 33 。maldi-tof ms 的检测操作简单且所需时间短， 可以在 30 min 内完成， 但这种鉴定方法的可行性还需要更多的试验来分析验证。7 念珠菌属耐药性检测利用maldi-tof ms 对念珠菌属真菌行耐药性鉴定是在不同浓度的抗菌药物中培养菌株，将 m

23、aldi-tof ms 作为一种快速检测其生长情况的手段，判断其对相应药物的耐药情况。这与传统检测方法基本原理相似，但是更节约时间。saracli等10 利用 maldi-tof ms 检测了一些念珠菌属真菌对三唑类抗真菌药物的耐药性。研究者将35 株白念珠菌、 35 株光滑念珠菌和37 株热带念珠菌各置于2 个浓度的氟康唑、伏立康唑或泊沙康唑中培养，设置对照组为不加抗菌药物培养基，利用 maldi-tof ms 检测在不同浓度药物中各菌株产生的谱图得到各菌株的cci，通过比较cci 值来判断各菌株是11 / 20 否耐药，将此结果与各菌株传统抗真菌药物敏感性试验（antifungal sus

24、ceptibility testing，afst）的结果进行对比。他们发现，利用maldi-tof ms 的耐药性鉴定结果与afst结果的一致率为54% 97% ， 其中在鉴定光滑念珠菌对泊沙康唑的耐药性上二者一致性最好。利用malditof ms 鉴定菌株耐药性的方面可重复性为54.3% 82.9% ，其中在白念珠菌对氟康唑的耐药性鉴定和光滑念珠菌对泊沙康唑的耐药性鉴定方面可重复性最好。在另一项研究中，意大利的研究者sanguinetti等34 也对利用 maldi-tof ms 鉴定光滑念珠菌的耐药性做了探究。他们的试验共纳入了98 株光滑念珠菌，并用分子生物学方法对这些菌株的耐药性进行了

25、鉴定。然后对这些菌株进行基于ms 的 afst （ms-afst） ：将 66 株菌株分别置含3 个不同浓度氟康唑的培养基中培养，32 株菌株分别置含3 个不同浓度阿尼芬净的培养基中培养，分析maldi-tof ms 检测的谱图得到各菌株于不同药物和不同药物浓度中的cci值，据此进行耐药性的判断。将判断结果与分子生物学鉴定结果对比显示，在38 株对氟康唑耐药的菌株中有 36 株被准确鉴定；28 株对氟康唑敏感的菌株全部被正确鉴定， 25 株对阿尼芬净耐药的菌株中有24 株被准确鉴定，在 7 株对阿尼芬净敏感的菌株中有6 株被准确鉴定。这些鉴定结果显示，ms-afst 或许因其快速性和准确性有望

26、推广应用，但这种方法尚无规范化的结果分析标准，而且其12 / 20 可重复性和稳定性还需要更多试验来验证。8 总结与展望体外药物敏感性试验是临床微生物实验室提供细菌和真菌耐药性结果的主要方法，同时，以培养鉴定为基础的检测方法仍然是细菌和真菌感染诊断的金标准。但目前普遍采用的体外药物敏感性试验时间长，不能满足临床诊疗的需求。maldi-tof ms 虽然尚未在体外药物敏感性检测中被广泛应用，但前期的研究已显示其具有很好的应用前景。要使其能够广泛应用，今后的研究必须完善其不足之处。一方面，maldi-tof ms 应用于细菌、真菌耐药性检测必须要有规范化的程序，需要对其图谱数据库和相应的分析软件进

27、行优化，借此也能产生更加自动化的操作程序，以降低对操作人员的要求；另一方面，其对不同病原菌的耐药性检测要有标准化、重复性好的结果判定指标，并使细菌耐药性结果判定与其最低抑菌浓度联系起来，以对临床用药给予具体的指导和建议。相信随着研究的深入进展，这项新的检测技术将带给临床微生物实验室再一次新的革命。参考文献：1胡付品，朱德妹，汪复，等. 2013 年中国 chinet 细菌耐药性监测j. 中国感染与化疗杂志，2014，14（5） ：365-374. 2汪复，朱德妹，胡付品，等. 2012 年中国 chinet 细菌耐药性监测 j. 中国感染与化疗杂志，2013，13（5） ：321-330. 3

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