《分子发光分析》ppt课件

1、第五章第五章 分子发光分析分子发光分析molecular luminescence molecular luminescence analysisanalysis目前，该分析方法广泛运用于生命物质目前，该分析方法广泛运用于生命物质DNADNA、蛋白质、糖类的检测，病毒、细胞等活性物质的蛋白质、糖类的检测，病毒、细胞等活性物质的分析，超痕量元素分析等！分析，超痕量元素分析等！DNADNA排序排序SARSAR病毒、禽流感病毒的检测病毒、禽流感病毒的检测单分子检测单分子检测目目 录录第一节第一节 概概 述述第二节第二节 分子荧光分析法分子荧光分析法第三节第三节 分子磷光分析法分子磷光分析法第四节第四

2、节 化学发光分析法化学发光分析法第一节第一节 概概 述述一、分子发光的定义一、分子发光的定义 基态分子遭到能量激发，吸收了一定能量基态分子遭到能量激发，吸收了一定能量后，跃迁至激发态，激发态分子在很短时后，跃迁至激发态，激发态分子在很短时间内以辐射跃迁发光方式释放能量并间内以辐射跃迁发光方式释放能量并前往基态，便产生了分子发光。前往基态，便产生了分子发光。外部能量光辐射基态激发态外部能量光辐射基态激发态根据激发方式不同，分子发光可分为光致发根据激发方式不同，分子发光可分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。光、热致发光、场致发光和化学发光等。其中，光致发光根据激发态不同可分为荧光其中，光

3、致发光根据激发态不同可分为荧光和磷光两种。和磷光两种。第一节第一节 概概 述述第二节第二节 分子荧光分析法分子荧光分析法 Molecular Fluorescence Analysis Molecular Fluorescence Analysis掌握要点：掌握要点：1.分子荧光分析法的定义、开展和特点；分子荧光分析法的定义、开展和特点；2.分子荧光的产生，荧光光谱及相关知识；分子荧光的产生，荧光光谱及相关知识；3.如何用分子荧光分析法进展定量测定；如何用分子荧光分析法进展定量测定；4.荧光分析仪器；荧光分析仪器；5.荧光分析法的运用。荧光分析法的运用。某些物质被紫外光照射激发到单重激发态后，

4、在回到基态某些物质被紫外光照射激发到单重激发态后，在回到基态的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，经过丈量荧光强度进的过程中发射出比原激发波长更长的荧光，经过丈量荧光强度进展定量分析的方法。展定量分析的方法。 一一. .分子荧光分析法的定义分子荧光分析法的定义紫外光紫外光荧光荧光基态基态单重激发态单重激发态二二. .分子荧光分析法的特点分子荧光分析法的特点1.灵敏度较紫外可见分析法高灵敏度较紫外可见分析法高24个数量级；个数量级；2.选择性较好；选择性较好；3.主要用于定量分析；主要用于定量分析；4.能发射荧光的物质较少，运用不如紫外可见广泛。能发射荧光的物质较少，运用不如紫外可见广泛。其高灵

5、敏度和许多生命物质都具有荧光性质，所以该方法在药物、其高灵敏度和许多生命物质都具有荧光性质，所以该方法在药物、临床、环境、食品的微量和痕量分析以及生命科学研讨上具有重临床、环境、食品的微量和痕量分析以及生命科学研讨上具有重要意义。要意义。三三. .分子荧光分析法的开展分子荧光分析法的开展 第一次记录荧光景象的是第一次记录荧光景象的是1616世纪西班牙的内科医生和植物学世纪西班牙的内科医生和植物学家家N.MonardesN.Monardes，15751575年他提到在含有一种称为年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum“LignumNephriticum的木头切片的水溶液中，呈

6、现了极为得意的木头切片的水溶液中，呈现了极为得意的天蓝色。的天蓝色。 在在1717世纪，世纪，BoyleBoyle1626169116261691和和NewtonNewton1624172716241727等等著名科学家再次察看到荧光景象。著名科学家再次察看到荧光景象。 18521852年，年，StokesStokes在调查奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计察在调查奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计察看到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这种景象是这看到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些，才判明这种景象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光。他还由发荧光的矿物些物质在吸收光能后重新发射不同

7、波长的光。他还由发荧光的矿物“萤石推演而提出萤石推演而提出“荧光这一术语荧光这一术语. . 入射光入射光荧光荧光StokesStokes还对荧光强度与浓度之间的关系进展了研讨，描画还对荧光强度与浓度之间的关系进展了研讨，描画了在高浓度时以及外来物质存在时的荧光猝灭景象。此外，他了在高浓度时以及外来物质存在时的荧光猝灭景象。此外，他还是第一个还是第一个18641864年提出运用荧光作为分析手段的人。年提出运用荧光作为分析手段的人。 18671867年，年，GoppelsrGoppelsr进展了历史上初次的荧光分析任务，运用进展了历史上初次的荧光分析任务，运用铝铝桑色素配合物的荧光进展铝的测定。桑

8、色素配合物的荧光进展铝的测定。 18801880年，年，LiebemanLiebeman提出了最早的关于荧光与化学构造关系的提出了最早的关于荧光与化学构造关系的阅历法那么。阅历法那么。 到到1919世纪末，人们曾经知道了包括荧光素、曙红、多环芳世纪末，人们曾经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等烃等600600种以上的荧光化合物。种以上的荧光化合物。 19 19世纪以前，荧光的察看是靠肉眼进展的，直到世纪以前，荧光的察看是靠肉眼进展的，直到19281928年，年，才由才由JetteJette和和WestWest提出了第一台光电荧光计。早期的光电荧光提出了第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度

9、是有限的，计的灵敏度是有限的，19391939年年ZworykinZworykin和和RajchmanRajchman发明光电倍发明光电倍增管以后，在添加灵敏度和允许运用分辨率更高的单色器等方增管以后，在添加灵敏度和允许运用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。面，是一个非常重要的阶段。19431943年年DuttonDutton和和BaileyBailey提出了一提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，种荧光光谱的手工校正步骤，19481948年由年由StuderStuder推出了第一台自推出了第一台自动光谱校正安装，到动光谱校正安装，到19521952年才出现商品化的校正光谱仪器。年才

10、出现商品化的校正光谱仪器。 荧光分析方法的开展，与仪器的开展是分不开的。荧光分析方法的开展，与仪器的开展是分不开的。目前，荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动目前，荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向开展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，化的方向开展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的运用范围大大扩展，普及于工业、农业、医药卫生、方法的运用范围大大扩展，普及于工业、农业、医药卫生、环境维护、公安情报和科学研讨等各个领域中。环境维护、公安情报和科学研讨等各个领域中。 四四. .分子荧光的原理分子荧光的原理分子轨道的多重态分子轨道的多重态假设分子中的电子自旋方向相反

11、的，此时假设分子中的电子自旋方向相反的，此时 S=0，M=l，这种态被称为，这种态被称为单重态或单重态或 S 态。普通分子的基态是单重态态。普通分子的基态是单重态S0，假设被激发时自旋方向没有改，假设被激发时自旋方向没有改动，那么得到激发单重态动，那么得到激发单重态S1、S2；假设被激发的电子在激发时自旋方向发生；假设被激发的电子在激发时自旋方向发生了改动，呈了改动，呈()或或()，那么，那么 S=1，M=3，此种态被成为三重态或，此种态被成为三重态或 T 态。态。 分子多重态分子多重态 M 定义为定义为M=2S+1 图中按能量的高低，将单重态与三重态分别以图中按能量的高低，将单重态与三重态分

12、别以 S0、S1、S2和和 T1、T2表示之。应该指出，三重态的能量总是低于相应的单重态的。表示之。应该指出，三重态的能量总是低于相应的单重态的。 电子跃迁态图解电子跃迁态图解 电子的跃迁需受电子的跃迁需受“选择律的限制选择律的限制 ，S0T1 禁阻跃迁几率很小。禁阻跃迁几率很小。荧光的产生荧光的产生人们16世纪就发现荧光景象，但真正懂得解释这一景象的时候，时间曾经过了300多年了首先，人们懂得在分子的角度上解释。首先，人们懂得在分子的角度上解释。对紫外光或可对紫外光或可见光产生选择见光产生选择性的吸收。性的吸收。电子跃迁电子跃迁到激发态到激发态. .具有不饱和具有不饱和键的基态分键的基态分子

13、子. .电子跃迁到激发态后，不稳定，要跃迁回基态，在这过程中能量需求被释放，电子跃迁到激发态后，不稳定，要跃迁回基态，在这过程中能量需求被释放，经过发光的方式和其他方式，我们称为辐射跃迁和非辐射跃迁。经过发光的方式和其他方式，我们称为辐射跃迁和非辐射跃迁。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l 2l 2l 1l 1l 3l 3 外转换l l 2 2T2内转换振动弛豫电子跃迁类型电子跃迁类型 电子处于激发态是不稳定形状，前往基态时，经过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传送途径传送途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移

14、系间跨越系间跨越振动弛预振动弛预无辐射跃迁 激发态停留时间短、前往速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；非辐射能量传送过程非辐射能量传送过程 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换方式由高振动能级至低相邻振振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换方式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10 -12 s10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中内转换：同多重度电子能级中, ,等能级间的无辐射能级交换。等能级间的无辐射能级

15、交换。 经过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单经过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭。猝灭。系间跨越：不同多重态系间跨越：不同多重态, ,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。 改动电子自旋，禁阻跃迁，经过自旋改动电子自旋，禁阻跃迁，经过自旋轨道耦合进展。轨道耦合进展。辐射能量传送过程辐射能量传送过

16、程 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态基态 多为多为 S1 S1 S0S0跃迁，发射波长为跃迁，发射波长为 2 2的荧光；的荧光； 10-7 10-710 -9 s 10 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 2 2 1 1 ； 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态基态 T1 S0 T1 S0跃跃迁；迁； 电子由电子由S0S0进入进入T1T1的能够过程：的能够过程： S0 T1 S0 T1禁阻

17、跃迁禁阻跃迁 S0 S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-4 10-4100 s 100 s 。 光照停顿后，可继续一段时间。光照停顿后，可继续一段时间。波长跟激发态基态能量差有关，强度与发生跃迁分子多少有关。波长跟激发态基态能量差有关，强度与发生跃迁分子多少有关。荧光和磷光光谱荧光和磷光光谱五五. .激发光谱与荧光激发光谱与荧光( (磷光磷光) )光谱光谱 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.荧光(磷光)的激发光谱曲线 固定丈量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关

18、系曲线 图中曲线I 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.2.荧光光谱荧光光谱( (或磷光光谱或磷光光谱) ) 固定激发光波长固定激发光波长( (选最大激发波选最大激发波长长), ), 化合物发射的荧光化合物发射的荧光( (或磷光强或磷光强度度) )与发射光波长关系曲线与发射光波长关系曲线( (图中曲图中曲线线IIII或或III)III)。450.0480500520540560580600620650.00.950100150200250300350400450500550600650700750.0nm 525.54,645.29554.73,657.69丁省的

19、激发光谱和荧光发射光谱丁省的激发光谱和荧光发射光谱波长nm200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱五五. .荧光效率和影响要素荧光效率和影响要素 1. 1.分子产生荧光必需具备的条件分子产生荧光必需具备的条件1 1具有适宜的构造；具有适宜的构造；2 2具有一定的荧光量子产率。具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率荧光量子产率：被激发的分子数产生荧光分子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；2.2.化合物的构造

20、与荧光化合物的构造与荧光1跃迁类型：跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；率常数小，有利于荧光的产生；2共轭效应：提高共轭度有利于添加荧光效率并产生红移共轭效应：提高共轭度有利于添加荧光效率并产生红移3刚性平面构造：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作刚性平面构造：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有类似构造，荧光用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有类似构造，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。4取代基效应：芳环取代基效应：芳环上有供电基，使荧光加上有供电基，使荧光加强。

21、强。3.3.影响荧光强度的要素影响荧光强度的要素 影响荧光强度的外部要素：影响荧光强度的外部要素：1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除普通溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的构除普通溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的构成都将使化合物的荧光发生变化；成都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度添加，外转换去活的荧光强度对温度变化敏感，温度添加，外转换去活的几率添加；几率添加；3. 3. 溶液溶液pHpH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pHpH的影响较大，需求严厉控制的影响较大，需求严厉控制；4.4.内滤光作用和自吸景象内滤光作用和自吸景象 自吸

22、景象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；5.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。一、定量根据一、定量根据荧光量子产率荧光量子产率：其中，其中，IfIf为荧光强度，为荧光强度，IaIa为被吸收的激发光强度。为被吸收的激发光强度。I0I0为入射光强度，为入射光强度，I I为透射光强度。为透射光强度。吸收的光量子数发射的光量子数IfIaIfI0-I由于A=lgI0I那么I

23、=I010-AIf= (I0-I)= I0(1-10-A)= I02.3A- - -(-2.3A)22!(-2.3A)33!当被测物浓度很小时，当被测物浓度很小时，A0.05A0.05， If= 2.3 If= 2.3I0A I0A 2.32.3I0kbCI0kbC五五. .荧光定量分析法荧光定量分析法If= 2.3I0kbCKC规范曲线法测定规范曲线法测定 丈量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、第一单色器、样品池、第二单色器、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 根本流程如图：根本流程如图：光源：氙灯和高压汞灯，光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器染料激光器( (可见与

24、紫外区可见与紫外区) )单色器：选择激发光波长单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射的第一单色器和选择发射光光( (丈量丈量) )波长的第二单色波长的第二单色器；器；检测器：光电倍增管。检测器：光电倍增管。二、仪器流程二、仪器流程三、荧光法的运用三、荧光法的运用1.单组分物质的直接测定和间接测定单组分物质的直接测定和间接测定1 1无机离子无机离子如如MgMg、AlAl、CaCa等，本身不发射荧光，但与有机试剂可等，本身不发射荧光，但与有机试剂可构成荧光配合物进展定量测定；构成荧光配合物进展定量测定；2 2有机化合物有机化合物本身发射荧光的，如罗丹明本身发射荧光的，如罗丹明B B、荧光素等可直接测定；、荧光素等可直接测定；不发射荧光的物质可经过处置后成为发射荧光的物质不发射荧光的物质可经过处置后成为发射荧光的物质进展测定；进展测定；3 3生命物质生命物质大部分的酶、蛋白质、维生素等可