酶法生产r-氨基丁酸工艺实验

1、生物工程工艺大实验酶法生产r-氨基丁酸工艺实验一、实验目的与原理1、实验目的 实验设置涉及生物产品氨基丁酸生产过程的基本单元操作和方法，强调锻炼基本操作能力，学习控制发酵培养基的配制与发酵罐的操作。掌握各种发酵实验仪器的使用方法及注意事项；掌握r-氨基丁酸酶法生产工艺，熟悉用浓缩等电法等从发酵液中提取氨基丁酸的基本流程。 实验原理 本实验利用酶法即用大肠杆菌对L-谷氨酸进行发酵，在L-谷氨酸脱羧酶作用下脱羧生成GABA和二氧化碳来制备GABA。 高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达12

2、1。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。离心原理：利用超高速的离心机将菌体与菌液分离。活性炭脱色：利用活性碳的吸附能力将溶液中的杂质吸附除去。 抽滤：减压过滤也就是抽滤,利用抽气泵使抽滤瓶中的压强降低,达到固液分离的目的。 减压浓缩：使用抽真空的方式降低水的沸腾温度使水蒸发干燥。 乙醇沉淀：伽马-氨基丁酸易容与水而不溶于乙醇，所以利用乙醇沉淀。2、 实验流程二、材料与方法1、菌种大肠杆菌GABA12102、主要仪器HYG-迴转式恒温调速摇瓶柜 GZX-9140 ME数显鼓风干燥箱LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 KQ-C型全自控蒸汽发生器BIOTECH-20

3、02 BIOPROCESS CONTROLLER PA98-2空气压缩机RS-232精密电子天平 YP1200电子天平FORMA 700 SERIES-80冷藏箱 DINGLI LD5-10离心机LDH系列生化培养箱 SHB-循环水式多用真空泵Heidolph G3减压浓缩机试管若干、锥形瓶、烧杯、玻璃棒、移液管、酒精灯、量筒3、主要试剂葡萄糖，玉米浆，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，乳糖，酵母粉，VH，青霉素，琼脂条，氢氧化钠固体，氢氧化钠溶液，活性炭，无水乙醇，L-谷氨酸4、分析方法4.1、菌种培养过程 首先进行菌种活化，然后将大肠杆

4、菌接种到固体斜面培养基（LB培养基+100mg/L青霉素）进行一代培养（37。12h），其后将固体斜面培养基上的菌种再进行二代培养（37，12h），再将二代菌种接种到种子培养基（葡萄糖0.3%，玉米浆3%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.1%， pH7.0，12115min）进行摇床培养，最后将种子培养基中的菌种接种到发酵罐（葡萄糖0.3%，乳糖1.6%，玉米浆3%，酵母粉0.3%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VH 1 mg/L， pH7.0，11515min。）进行发酵培养，培养条件为pH7.0，温度34-36培养至OD600nm*20=10-15，培养时间8-10h

5、。4.2、谷氨酸测定 将反应结束后的发酵液放入离心管中进行离心，然后取离心管中的上清液放入仪器中用酶膜法进行谷氨酸的测定。4.3、残糖测定 在大肠杆菌生长至对数生长末期至稳定期时，离心，过0.22 um膜。取不含菌体的滤出液用三五二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量。4.4、pH测定 在配置培养基过程中要用pH6.4-8.0精密pH试纸测定培养基pH。发酵过程中，要用广泛pH试纸对发酵液的pH进行测定。酶促反应过程中，用pH6.4-8.0精密试纸对pH进行检测。4.5、吸光度测定  1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。   

6、2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）   3.根据所需波长转动波长选择钮至600nm处。   4.将空白液即蒸馏水及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。   5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。   6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。   7.比色完毕

7、，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。 4.6、 氨基丁酸的测定用活性炭吸附溶液中的蛋白，加入无水酒精沉淀，其后减压浓缩结晶、抽滤得晶体9.1g，理论收率为65%。三、实验过程与结果1、发酵培养1.1、摇瓶种子培养记录种子接种量：100ml×5 pH6.4 培养时间：21：30-8：00共10.5h、OD600*20：0.258 转速：172r/min 测量温值PV：28.9 设定温值SV：30.01.2、发酵培养记录批号：2014122530L发酵罐发酵记录时间/hpH溶氧/%转速/rpmOD600风量L/min罐压/MPa温度/0.148.52177.73000.0

8、615.70.06933.21.006.17139.2300O.0593.80.03235.82.006.20122.83000.0812.30.02435.93.006.4591.73000.1162.20.02336.04.006.3165.33500.1482.40.02336.05.006.3152.84100.2042.40.02336.06.006.3148.54500.2982.30.02336.07.006.6176.75000.3972.00.02336.08.006.6341.74190.4470.80.01536.09.006.7058.94190.7300.80.015

9、35.910.006.8184.13990.6080.80.01535.8过程：每隔一小时取少量发酵液于试管中，取0.5ml发酵液与9.5ml水混合，测OD值。PH、溶氧均可用电极直接测出。当溶氧低于30%，要适当提高转速以增加溶氧。2、菌体收集项目体积菌体OD过滤前发酵液3L0.258过滤后发酵液2L0.608过程：发酵完成后，将发酵液进行过滤并测量OD值。3、酶催化反应菌体量反应液体积投料谷氨酸量反应温度反应pH反应时间0.5L0.65L100g364.04h过程：取冷冻后的菌液进行离心，分离菌体与上清液，将谷氨酸加至上清液进行酶促反应，在恒温条件下谷氨酸转化为伽马-氨基丁酸，因为脱羧产生

10、二氧化碳，反应时会有大量气泡产生。4、氨基丁酸的提取4.1离心料液体积离心时间转速离心后体积500ml10min3500r/min450ml过程：将反应液置于离心机中，经高速离心，得上清液。4.2 脱色实验批次发酵液体积活性炭用量脱色时间pH1450ml4.5g6min7.0过程：因为溶液中任含有杂质，加入活性炭进行吸附，将有色物质除去，得到澄清的伽马-氨基丁酸溶液。4.3 浓缩结晶实验批次浓缩前发酵液体积含量浓缩后体积加酒精体积产品质量纯度收率1400ml200ml75ml30048.36g100%80.6%计算过程：400ml反应液-氨基丁酸的理论质量为60g 200ml反应液-氨基丁酸的

11、理论质量为30g 实际产品质量为48.36g实际收率：（48.36÷60）×100%=80.6%误差分析：1.谷氨酸经酶促反应并未反应完全，所以导致产率低下。2.离心分离不彻底，菌体与溶液分离不彻底，导致抽滤时不够彻底，少量伽马-氨基丁酸溶液未被抽滤完全，导致实际收率低。 3.结晶时酒精浓度不够纯，部分伽马-氨基丁酸晶体溶于酒精溶液中，使产率下降。4.在浓缩过程中，因高温使部分伽马-氨基丁酸晶体析出附于浓缩烧瓶壁中，这些贴附于瓶壁的晶体无法取出，所以实际产率会略低。四、收获与体会通过这次实验，让我体会最深的就是，书面知识与实际操作的结合。感觉二者缺一不可，不具备完整的知识储备根本不知道从何下手，知道怎么做了再