3[1].水产微生物学与免疫学病毒学基础

1、水产微生物学与免疫学水产微生物学与免疫学2011年年3月月联系电话：联系电话13078553720Email：v第一章第一章 绪论绪论v第二章第二章 细菌学基础细菌学基础v第三章第三章 病毒学基础病毒学基础v第四章第四章 其它类型微生物其它类型微生物v第五章第五章 免疫学基础免疫学基础v第六章第六章 水生动物病原水生动物病原水产微生物学与免疫学水产微生物学与免疫学教学内容教学内容第一节第一节 病毒概述病毒概述第二节第二节 病毒结构病毒结构第三节第三节 病毒增殖病毒增殖第四节第四节 病毒致病病毒致病第五节第五节 病毒鉴定病毒鉴定第六节第六节 噬菌体和亚病毒噬菌体和亚病

2、毒第三章第三章 病毒学基础病毒学基础第一节第一节 病毒概述病毒概述一一. 人们对病毒的认识过程人们对病毒的认识过程二二. 病毒的概念和特点病毒的概念和特点三三. 病毒与其他微生物的区别病毒与其他微生物的区别墨墨西西哥哥流流感感疫疫情情 一、一、人们对病毒的认识过程人们对病毒的认识过程18921892：俄国：俄国 伊万诺夫斯基伊万诺夫斯基 首次发现烟草花叶病毒的感染因子能通过细菌过滤器。首次发现烟草花叶病毒的感染因子能通过细菌过滤器。18981898：荷兰：荷兰 贝哲林克贝哲林克 证实该致病因子可以被乙醇从悬液中证实该致病因子可以被乙醇从悬液中沉淀沉淀下来而不失去其感染性下来而不失去其感染性 但

3、用培养细菌的方法培养不出来；给这样的病原体起名叫但用培养细菌的方法培养不出来；给这样的病原体起名叫virusvirus。19351935：美国：美国 斯坛莱斯坛莱 从烟草花叶病病叶中提取出了病毒结晶，从烟草花叶病病叶中提取出了病毒结晶，又证实又证实了结晶中含核酸和了结晶中含核酸和 蛋白质两种成分，而只有核蛋白质两种成分，而只有核酸具酸具感染和复制能力，并因此而获得诺贝尔奖。感染和复制能力，并因此而获得诺贝尔奖。19521952：HersheyHershey和和ChaseChase证实噬菌体的遗传物质仅仅是证实噬菌体的遗传物质仅仅是DNADNA，开创了病毒分子生物学。，开创了病毒分子生物学。19

4、711971后：后： 陆续发现了各种亚病毒陆续发现了各种亚病毒类病毒、朊病毒和拟病毒类病毒、朊病毒和拟病毒。烟烟草草花花叶叶病病毒毒二、病毒的概念和特点二、病毒的概念和特点( (一一) )病毒的概念：病毒的概念： 是指一类体积极小、结构简单、只有一种核酸类型、只能在活的敏感细胞内进行复制方式增殖的非细胞型微生物。猪流感病毒猪流感病毒(50000倍倍) (二二) 病毒的特点病毒的特点：1. 1. 体积微小，能通过细菌滤器，需用体积微小，能通过细菌滤器，需用EMEM才能观察到；才能观察到；2. 2. 结构简单，不具有细胞形态，属非细胞型微生物；结构简单，不具有细胞形态，属非细胞型微生物；3. 3.

5、 主要成分为蛋白质和核酸，且只有一种核酸：主要成分为蛋白质和核酸，且只有一种核酸：RNARNA或或DNADNA；4. 4. 专性寄生，依靠宿主细胞的合成系统进行增殖；专性寄生，依靠宿主细胞的合成系统进行增殖；5. 5. 离体时能以无生命状态存在，可保持其感染性；离体时能以无生命状态存在，可保持其感染性；6. 6. 对一般抗生素不敏感，对干扰素敏感。对一般抗生素不敏感，对干扰素敏感。电子显微镜电子显微镜 三、病毒与其他微生物的比较三、病毒与其他微生物的比较 敏 感 性微 生 物种 类 结 构在 无 活 细胞 的 培 养基 中 生 长二 等 分 裂繁 殖核 酸 类 型 核 糖 体抗 生 素干 扰

6、素细 菌原 核 细 胞 型+DNA，RNA+-支 原 体原 核 细 胞 型+DNA，RNA+-立 克 次 体原 核 细 胞 型-+DNA，RNA+-衣 原 体原 核 细 胞 型-+DNA，RNA+-螺 旋 体原 核 细 胞 型-（+）+DNA，RNA+-真 菌真 核 细 胞 型+出芽、产生孢子DNA，RNA+-病 毒非 细 胞 型-DNA 或 RNA-+本节学习要点：本节学习要点： 1. 病毒的概念。 2. 病毒的特点病毒的特点。 3. 病毒与其他 微生物区别。一一. . 病毒的大小病毒的大小二二. . 病毒的形态病毒的形态三三. . 病毒的结构病毒的结构四四. . 病毒的组分病毒的组分第二节

7、第二节 病毒结构病毒结构第二节第二节 病毒结构病毒结构测定大小的单位是纳米（nm，109)多数病毒的直径在100nm以下；绝大多数病毒是能通过细菌滤器；须用电镜才能观察到其具体形态和大小。一、病毒的大小一、病毒的大小二、病毒的形态二、病毒的形态 病毒粒子的形态多种多样，其中以球形或近球形多见，也有杆状、丝状、弹状、砖形及蝌蚪形等。Sizes and Shapes of Viruses (Animal RNA Viruses)小RNA病毒 呼肠孤病毒 披膜病毒 正粘病毒冠状病毒 副粘病毒 逆转录病毒 弹状病毒Sizes and Shapes of Viruses (Animal DNA Viru

8、ses) 乳多空病毒 腺病毒 疱疹病毒HIVHSVTMV病毒大小与形态的研究方法病毒大小与形态的研究方法(1)(1)电子显微镜法：电子显微镜法：超薄切片或直接负染，电镜下观察其形态并测量其大小；(2)(2)超滤膜过滤法：超滤膜过滤法：通过不同孔径的滤膜过滤，可估计病毒的大小；(3)(3)超速离心法：超速离心法：通过超速离心，测得其沉降系数，可计算病毒大小；(4)(4)电离辐射与电离辐射与X X线衍射法：线衍射法：主要用于研究病毒粒子的亚单位结构等。电子显微镜电子显微镜 超滤系统超滤系统超速离心机超速离心机三、病毒的结构三、病毒的结构基本结构基本结构辅助结构辅助结构病病毒毒核芯(core)衣壳(

9、capsid)核衣壳(nucleocapsid)囊膜或包膜(membrane or envelope)其他辅助结构，如腺病毒衣壳上触 须样纤维( (一一) )病毒的基本结构病毒的基本结构Enveloped Viruscapsidcapsid corecoreenvelopespikespikeNaked VirusNaked VirusCapsomere or capsomerTransmission Electron Micrograph of HIV-1 The nucleocapsid (arrows) can be seen within the envelope. 猪繁殖与呼吸综合征

10、病毒结构猪繁殖与呼吸综合征病毒结构 ( (二二) )病毒的对称性病毒的对称性三类典型形态的三类典型形态的病毒病毒廿面体对称廿面体对称的的结构结构( (球状球状) ) 螺旋对称螺旋对称的结构的结构( (杆状杆状) ) 复合对称复合对称的结构的结构( (蝌蚪状蝌蚪状) ) 五邻体六邻体二十面体对称型病毒(1)二十面体对称型病毒(2)Tobacco Mosaic Virus螺旋对称型病毒(1)DNA或RNA壳粒螺旋对称型病毒(2)T4 Bacteriophage复合对称型病毒四、病毒的组分四、病毒的组分 病毒的主要成分为核酸病毒的主要成分为核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)和蛋白质；有的病毒还

11、和蛋白质；有的病毒还含有脂质、糖类等其他组分。含有脂质、糖类等其他组分。1 1、病毒的核酸、病毒的核酸一种病毒只含有一种核酸（一种病毒只含有一种核酸（DNA或或RNA）。）。 植物病毒绝大多数含植物病毒绝大多数含DNA；少数含；少数含RNA； 动物病毒一部分含动物病毒一部分含DNA，一部分含，一部分含RNA； 细菌病毒普遍含细菌病毒普遍含DNA，含，含RNA的极少。的极少。病毒的核酸类型极为多样化：病毒的核酸类型极为多样化： 病毒的病毒的DNA与与RNA均有单链和双链：均有单链和双链： dsDNA或或ssDNA， dsRNA或或ssRNA 病毒病毒DNA分子有分子有线状线状和和环状环状之分。之

12、分。病毒核酸还有病毒核酸还有正链正链()和和负链负链()的区分：的区分： 规定：将碱基序列与规定：将碱基序列与mRNA一致的核酸单链定为一致的核酸单链定为正链正链；将碱基序列与；将碱基序列与mRNA互补的核酸单链定为互补的核酸单链定为负链负链。因此，病毒核酸有以下因此，病毒核酸有以下6 种类型：种类型： () DNA大部分大部分DNA病毒病毒 () RNA动物呼肠孤病毒动物呼肠孤病毒 （）（）DNA 大肠杆菌大肠杆菌 X174噬菌体噬菌体 （）（）RNA所有单链所有单链RNA病毒病毒 （）DNA腺病毒腺病毒 （）RNA 流感病毒流感病毒 有的病毒只有一种蛋白质，多数含有几种蛋白质。有的病毒只有

13、一种蛋白质，多数含有几种蛋白质。 病毒蛋白质的氨基酸组成与其他生物一样，但不同病毒蛋白质的氨基病毒蛋白质的氨基酸组成与其他生物一样，但不同病毒蛋白质的氨基酸组成和含量各不相同。酸组成和含量各不相同。 病毒蛋白质主要在构成病毒的结构、侵染与增殖过程中发挥作用。病毒蛋白质主要在构成病毒的结构、侵染与增殖过程中发挥作用。2. 2. 病毒的蛋白质病毒的蛋白质病毒衣壳的功能：病毒衣壳的功能：A. 保护核酸免受核酸酶及理化因素的破坏；B. 具有与宿主细胞表面受体结合的结构； 无囊膜病毒衣壳蛋白，能参与病毒的吸附、进入，决定病毒的宿主嗜性。C. 衣壳蛋白具有良好的抗原性，能诱发宿主机体产生细胞免疫和体液免疫

14、。 病毒的衣壳：病毒的衣壳：是由大量的同一的衣壳蛋白单体分子即蛋白亚基(protein subunit)以次级键结合构成。3. 病毒的脂质与糖类 主要构成病毒的囊膜囊膜(membrane or envelope) 某些病毒在宿主细胞内成熟过程中，以出芽方式穿过核膜和或胞质膜、空泡膜等释放到宿主细胞外时，获得的一种宿主细胞脂质成分。 病毒的囊膜与其他生物膜相似，也是一种脂质双层膜；在囊膜形成时，宿主细胞的膜蛋白被病毒的囊膜蛋白取代。 在病毒囊膜的表面，常有一些向外凸出的突起，成为刺突(spike)。囊膜的功能：囊膜的功能： A. 病毒囊膜与宿主细胞膜具有一定的同源性，易于亲和与融合，辅助病毒的感

15、染作用；病毒囊膜与宿主细胞膜具有一定的同源性，易于亲和与融合，辅助病毒的感染作用； B. 病毒囊膜为脂质双层膜，对脂溶剂敏感，可作为鉴定病毒的一个指标；病毒囊膜为脂质双层膜，对脂溶剂敏感，可作为鉴定病毒的一个指标； C. 病毒囊膜蛋白能与宿主细胞表面受体结合，介导病毒的吸附与穿入；病毒囊膜蛋白能与宿主细胞表面受体结合，介导病毒的吸附与穿入； D. 病毒囊膜蛋白具有良好的抗原性，可刺激宿主机体产生免疫应答；病毒囊膜蛋白具有良好的抗原性，可刺激宿主机体产生免疫应答； E. 病毒囊膜蛋白还具有凝集动物红细胞、促进细胞融合等特性。病毒囊膜蛋白还具有凝集动物红细胞、促进细胞融合等特性。本节学习要点： 1

16、. 病毒的大小与形态。 2. 研究病毒大小与形态的方法。 3. 病毒的基本结构与对称性。 4. 病毒核酸的特点与类型 5. 病毒衣壳的功能。 6. 病毒囊膜的本质与功能。第三节第三节 病毒增殖病毒增殖一、病毒增殖的特点与方式一、病毒增殖的特点与方式二、病毒的增殖过程二、病毒的增殖过程 (一) 吸附和穿入(adsorption and penetration) (二) 脱壳(uncoating) (三) 生物合成(biosynthesis) (四) 装配与释放(assembly and release)三、病毒的异常增殖现象三、病毒的异常增殖现象四、病毒增殖的干扰现象与干扰素四、病毒增殖的干扰现

17、象与干扰素一、病毒增殖的特点及方式一、病毒增殖的特点及方式 1. 1. 病毒增殖的特点病毒增殖的特点 隐蔽期隐蔽期 增殖期增殖期 无囊膜病毒：抑制宿主细胞的增殖，裂解释放 有囊膜病毒：和宿主细胞共同增殖，“出牙”释放 肿瘤病毒：整合到宿主细胞基因组，可传到下一代 2. 2. 病毒增殖的方式病毒增殖的方式 自我复制自我复制X射线拍照的病毒射线拍照的病毒 二、病毒的增殖过程二、病毒的增殖过程 (一) 吸附和穿入(adsorption and penetration) (二) 脱壳(uncoating) (三) 生物合成(biosynthesis) (四) 装配与释放(assembly and re

18、lease)(一一) Adsorption and Penetration1. 病毒的吸附病毒的吸附(Adsorption) (1) 静电吸附静电吸附: 可逆，非特异的。在可逆，非特异的。在pH7时，病毒与宿主细胞均带负时，病毒与宿主细胞均带负电荷，不易接触，但有电荷，不易接触，但有Ca2+和和Mg2+等阳离子的存在时，可降低负电荷，等阳离子的存在时，可降低负电荷，促进静电吸附。促进静电吸附。 (2) 特异性吸附：特异性吸附：病毒与易感细胞上特异性受体相结合。病毒与易感细胞上特异性受体相结合。HIVHIV的吸附现象的吸附现象 2. 病毒的穿入病毒的穿入(Penetration) (1) 膜融合

19、：病毒囊膜与宿主细胞膜融合，将其内部组分释放 到细胞质中，如HIV、NDV等艾滋病病毒的膜融合现象艾滋病病毒的膜融合现象 (2) 胞吞作用：多数病毒按此方式侵入；宿主细胞对流感病毒的胞吞现象宿主细胞对流感病毒的胞吞现象(3) 完整病毒穿过细胞膜的完整病毒穿过细胞膜的移位方式，如腺病毒（二）（二）uncoating噬菌体胞外脱壳噬菌体胞外脱壳2流感病毒的脱壳现象流感病毒的脱壳现象（三）（三） Biosynthesis病毒核酸复制病毒核酸复制1、病毒核酸的复制、病毒核酸的复制病毒核酸链接入寄主核酸链病毒核酸链接入寄主核酸链2 2、病毒核酸的转录、病毒核酸的转录l含含DNADNA的病毒的病毒: :D

20、NAmRNADNAmRNAl+DNA+DNA病毒病毒:+DNA:+DNADNAmRNADNAmRNAl含含RNARNA病毒病毒: :RNAmRNARNAmRNAl含含+RNA+RNA病毒病毒:+RNA:+RNARNAmRNARNAmRNAl含含-RNA-RNA病毒病毒:-RNA:-RNAmRNAmRNA艾滋病病毒艾滋病病毒(HIV)的转录的转录 3 3、病毒蛋白的合成、病毒蛋白的合成（四）（四） assembly and release 噬菌体噬菌体大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病大肠杆菌死亡并破裂，释放出里面的病毒，新一代病毒开始新的生命旅程毒，新一代病毒开始新的生命旅程2、病毒的释放、病

21、毒的释放( release )病病毒毒的的增增殖殖过过程程脊脊髓髓灰灰质质炎炎病病毒毒的的增增殖殖过过程程疱疹病毒的复制过程三、病毒的异常增殖现象三、病毒的异常增殖现象不完全复制不完全复制: : 可以合成部分或全部病毒成分，但不能正常装配。缺陷病毒缺陷病毒(defective virus )： 基因组不完整的病毒体缺陷干扰颗粒缺陷干扰颗粒(defective interfering particles, DIP)：指缺陷病毒不能复制，但却能 干扰同种成熟病毒进入细胞。天然缺陷病毒：天然缺陷病毒：腺病毒伴随病毒顿挫感染顿挫感染(abortive infection)：细胞条件不合适，病毒进入细胞

22、但不能复制。腺腺病病毒毒伴伴随随病病毒毒四、病毒增殖的干扰现象与干扰素四、病毒增殖的干扰现象与干扰素 1. 病毒增殖的干扰现象病毒增殖的干扰现象 当两种病毒同时感染同一细胞时，一种病毒的增殖可抑制了另一种病毒增殖。 产生原因： (1) 有干扰素(interferon，IFN)的存在； (2) 第一种病毒改变了细胞表面共用受体结构； (3) 第一种病毒改变了细胞代谢途径； (4) 第一种病毒抑制第二种病毒mRNA的转译(interferon，IFN)本节学习要点：本节学习要点： 1. 病毒增殖的特点。 2. 病毒增殖的基本过程。病毒增殖的基本过程。 3. 病毒的异常增殖现象。 4. 干扰素的概念

23、和作用。第四节第四节 病毒致病病毒致病一、病毒的细胞培养一、病毒的细胞培养二、病毒与细胞的相互作用二、病毒与细胞的相互作用三、病毒的致病机制三、病毒的致病机制一、病毒的细胞培养一、病毒的细胞培养 SPF动物或动物或SPF鸡胚，仍常用于培养病毒，但病毒的细胞培养发展最快，鸡胚，仍常用于培养病毒，但病毒的细胞培养发展最快，重点介绍。重点介绍。 细胞细胞(包括组织器官包括组织器官)培养法培养法鸡胚培养法鸡胚培养法实验动物培养法实验动物培养法常见的病毒培养方法有常见的病毒培养方法有 1、病毒细胞培养、病毒细胞培养 概念概念：将适宜组织中的细胞分散，在培养液中进行细胞培养，再接种病毒，让病毒在细将适宜组

24、织中的细胞分散，在培养液中进行细胞培养，再接种病毒，让病毒在细胞中繁殖来培养病毒的方法。胞中繁殖来培养病毒的方法。用途用途：用于病毒学研究，如用于病毒学研究，如病毒病毒分离、病毒克隆纯化、病毒病诊断及疫苗制备等。分离、病毒克隆纯化、病毒病诊断及疫苗制备等。特点特点：一致性好，材料易得，易标准化试验，可重复性好。：一致性好，材料易得，易标准化试验，可重复性好。 可通过细胞病变判定病毒感染，也可结合免疫学技术检测细胞内病毒。可通过细胞病变判定病毒感染，也可结合免疫学技术检测细胞内病毒。2、细胞培养类型、细胞培养类型 (1) 原代细胞原代细胞 动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个细胞悬液，再生长

25、于培养器皿中。制备原代动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个细胞悬液，再生长于培养器皿中。制备原代细胞，肾和睾丸最为常用，以来源于细胞，肾和睾丸最为常用，以来源于SPF胚胎或幼畜组织的细胞为好。胚胎或幼畜组织的细胞为好。 (2)传代细胞系传代细胞系 在体外培养液中可无限制分裂传代的细胞。一般来源于肿瘤组织。有已建立的很多传代细在体外培养液中可无限制分裂传代的细胞。一般来源于肿瘤组织。有已建立的很多传代细胞系，如胞系，如Hel6(人子宫癌细胞人子宫癌细胞)、Vero(非洲绿猴肾细胞非洲绿猴肾细胞)、PK-15(猪肾细胞猪肾细胞)等。等。 优点：优点：传代及培养方便，使用广泛。传代及培养方便，使

26、用广泛。 缺点：缺点：对有的病毒不敏感；传代日久易被霉形体污染或对有的病毒不敏感；传代日久易被霉形体污染或 病毒隐性感染；有致肿瘤的潜在危险病毒隐性感染；有致肿瘤的潜在危险猪甲状腺细胞原代培养猪甲状腺细胞原代培养 C6:大鼠神经胶质瘤成纤维细胞大鼠神经胶质瘤成纤维细胞3、细胞培养的方法、细胞培养的方法 最常用的方法为最常用的方法为静置培养静置培养及及旋转培养旋转培养。还可用。还可用悬浮培养悬浮培养或或微载体培养微载体培养技术等。技术等。 (1) 静置培养静置培养：将消化分散的细胞悬液分装于培养瓶将消化分散的细胞悬液分装于培养瓶(管管)或培养板或培养板(孔孔)，封闭，静置于恒温，封闭，静置于恒温

27、箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。如用细胞培养板，一般需培养在含箱内，数天后细胞可生成贴壁的单层细胞。如用细胞培养板，一般需培养在含5的的CO2条件条件下。哺乳动物及禽类的细胞培养温度一般为下。哺乳动物及禽类的细胞培养温度一般为37。 (2) 旋转培养：旋转培养：与静置培养相同，不同之处是要培养的细胞不断缓慢旋转与静置培养相同，不同之处是要培养的细胞不断缓慢旋转(5-10rpm)，经过，经过一段时间，细胞可在培养瓶一段时间，细胞可在培养瓶(管管)的四壁长满单层。此法的产量高，适用于疫苗生产。的四壁长满单层。此法的产量高，适用于疫苗生产。静置培养静置培养旋转培养旋转培养 (3) 悬浮培养悬浮

28、培养：通过搅拌使细胞处于悬浮状态，井补充营养和校正通过搅拌使细胞处于悬浮状态，井补充营养和校正pH，使之生长或维持存，使之生长或维持存活。适用某些不需贴壁生长的细胞系，如活。适用某些不需贴壁生长的细胞系，如NS1(一种骨髓瘤细胞系一种骨髓瘤细胞系) 。 (4) 微载体培养微载体培养：是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。微载体是直径是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。微载体是直径35-100um微小颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的微小颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法增加，

29、用于规模化细胞或疫苗生产。细胞数也比上述常规方法增加，用于规模化细胞或疫苗生产。悬浮培养悬浮培养微载体培养微载体培养二、病毒与细胞的相互作用二、病毒与细胞的相互作用 病毒与宿主细胞之间作用的表现形式各异。病毒基因往往能诱导、模病毒与宿主细胞之间作用的表现形式各异。病毒基因往往能诱导、模拟或封闭宿主细胞的功能。反之，宿主细胞防御系统也能封闭病毒的增殖。拟或封闭宿主细胞的功能。反之，宿主细胞防御系统也能封闭病毒的增殖。 1、病毒与细胞相互作用的类型、病毒与细胞相互作用的类型 宿主细胞感染病毒发生的变化有宿主细胞感染病毒发生的变化有杀细胞反应杀细胞反应非杀细胞反应非杀细胞反应细胞死亡细胞死亡：杀细胞

30、、细胞病变、细胞裂解杀细胞、细胞病变、细胞裂解生产性变化生产性变化：细胞存活、允许病毒增殖、分泌释放细胞存活、允许病毒增殖、分泌释放非生产性变化非生产性变化：细胞存活、阻断病毒复制细胞存活、阻断病毒复制转化转化：病毒基因与细胞基因整合，可致肿瘤病变病毒基因与细胞基因整合，可致肿瘤病变具体表现为具体表现为细胞裂解细胞裂解2 2、病毒引致的杀细胞变化、病毒引致的杀细胞变化 某些病毒接种培养的单层细胞后，第一轮感染产生的子代病毒将蔓延感染某些病毒接种培养的单层细胞后，第一轮感染产生的子代病毒将蔓延感染邻近的细胞，最终感染所有细胞。感染导致的细胞损伤称之为邻近的细胞，最终感染所有细胞。感染导致的细胞损

31、伤称之为细胞病变细胞病变(CPE)。CPE可在光学显微镜下观察，是病毒学检测及研究的常规手段之一。通常用可在光学显微镜下观察，是病毒学检测及研究的常规手段之一。通常用CPE作为指标来判定病毒的毒力，即计算病毒的半数细胞感染量作为指标来判定病毒的毒力，即计算病毒的半数细胞感染量(TCID50)。 细胞病变细胞病变(CPE)包括包括涉及细胞膜的涉及细胞膜的CPE（细胞膜融合）、（细胞膜融合）、涉及细胞骨架的涉及细胞骨架的CPE、病毒引致的细胞凋亡与坏死病毒引致的细胞凋亡与坏死 。正常细胞正常细胞CPE3、空斑形成、空斑形成 将将1010倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于单

32、层细胞单层细胞，而后在细胞上覆盖一层，而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂含营养液的琼脂，以防止游离的病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。以防止游离的病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态，称为形成一个近似圆形的斑点，类似固体培养基上的菌落形态，称为空斑或蚀斑空斑或蚀斑（细胞病变）。（细胞病变）。 一个空斑可能由一个以上病毒颗粒感染所致，因此可将获得的单个空斑一个空斑可能由一个以上病毒颗粒感染所致，因此

33、可将获得的单个空斑制作悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的制作悬液，梯度稀释后再作空斑，最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的空斑，这就是空斑，这就是病毒克隆病毒克隆。借助空斑技术不仅可。借助空斑技术不仅可纯化病毒纯化病毒，还对病毒定量，定，还对病毒定量，定量单位称为量单位称为空斑形成单位空斑形成单位(PFU)。 通过通过PFUPFU计数及计数及PFUPFU减数试验，可滴定血清效价、测定干扰素活性等。减数试验，可滴定血清效价、测定干扰素活性等。通过通过PFU计数及计数及PFU减数试验减数试验4 4、包涵体、包涵体 包涵体包涵体是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，可

34、通过固定染色后在是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，可通过固定染色后在光学显微镜下检测。包涵体光学显微镜下检测。包涵体位置位置(核内或胞浆核内或胞浆)、数量数量(单个或多个单个或多个)、大小大小(较大或较较大或较小小)、形态形态(圆形或无规律形态圆形或无规律形态)和和染色性染色性嗜酸嗜酸(伊染成粉红色染成粉红色)或或嗜碱嗜碱(苏木精染成蓝苏木精染成蓝色色)，因病毒的种类而异，可用于诊断。，因病毒的种类而异，可用于诊断。巨细胞病毒包涵体狂犬病毒包涵体 5、病毒引致的非杀细胞变化、病毒引致的非杀细胞变化 非杀细胞病毒的感染通常引致持续感染，对细胞的新陈代谢并无大碍，非杀细胞病毒的感染通常引致

35、持续感染，对细胞的新陈代谢并无大碍，但同时还生产并释放子代病毒颗粒。除少数例外，大多持续感染的细胞发生但同时还生产并释放子代病毒颗粒。除少数例外，大多持续感染的细胞发生慢性渐进性变化，最终死亡慢性渐进性变化，最终死亡。 6、病毒的干扰现象、病毒的干扰现象 主要是由干扰素介导。主要是由干扰素介导。 干扰素并无病毒特异性干扰素并无病毒特异性，例如副粘病毒感染诱导的干扰素对披膜病毒，例如副粘病毒感染诱导的干扰素对披膜病毒感染完全有效。干扰素在分泌部位或经循环至全身。通常在病毒感染早期感染完全有效。干扰素在分泌部位或经循环至全身。通常在病毒感染早期即在第一批子代病毒释放之时产生于从而对相邻细胞及机体产

36、生保护作用。即在第一批子代病毒释放之时产生于从而对相邻细胞及机体产生保护作用。病毒与宿主细胞相互作用的结果可引致宿主的临床和病理变化。病毒与宿主细胞相互作用的结果可引致宿主的临床和病理变化。三、三、 病毒的致病机制病毒的致病机制病毒对组织器官包括免疫器官等的损伤病毒对组织器官包括免疫器官等的损伤宿主对病毒入侵产生的相应变化宿主对病毒入侵产生的相应变化 病毒对动物的致病机制包病毒对动物的致病机制包括括 (1)对宿主组织和器官的直接损伤对宿主组织和器官的直接损伤 某些杀细胞性病毒对细胞直接损伤引致机体的临床症状和病理变化。某些杀细胞性病毒对细胞直接损伤引致机体的临床症状和病理变化。 1、病毒感染对

37、寄主组织器官的损伤、病毒感染对寄主组织器官的损伤 病毒致病的严重程度与其在组织细胞引致的病变程度并无直接关系。病毒致病的严重程度与其在组织细胞引致的病变程度并无直接关系。病毒引起的细胞和组织损伤是否会产生临床疾病因器官而异。病毒引起的细胞和组织损伤是否会产生临床疾病因器官而异。 对呼吸道上皮的损伤：对呼吸道上皮的损伤： 呼吸道病毒最初入侵并损伤上皮细胞，逐步损坏呼吸道粘膜的保护层，呼吸道病毒最初入侵并损伤上皮细胞，逐步损坏呼吸道粘膜的保护层，暴露出越来越多的上皮细胞。感染后期当上皮细胞损坏时，纤毛停止摆动。暴露出越来越多的上皮细胞。感染后期当上皮细胞损坏时，纤毛停止摆动。呼吸道表面上皮的退化性

38、变化非常迅速，但能迅速再生。呼吸道表面上皮的退化性变化非常迅速，但能迅速再生。 对消化道上皮的损伤：对消化道上皮的损伤： 病毒对消化道的感染多数呈潜伏期短，没有任何前驱症状。轮状病毒病毒对消化道的感染多数呈潜伏期短，没有任何前驱症状。轮状病毒等感染后相邻肠绒毛有时发生融合，肠道吸收面积减少，导致肠腔中粘液等感染后相邻肠绒毛有时发生融合，肠道吸收面积减少，导致肠腔中粘液积累并腹泻。细小病毒感染损伤分化中的肠腺上皮。积累并腹泻。细小病毒感染损伤分化中的肠腺上皮。 (2) 无组织器官损伤时所致的病理变化无组织器官损伤时所致的病理变化 某些病毒感染引起的某些病毒感染引起的损伤不明显损伤不明显，感染细胞

39、仍能低效地执行正常或低，感染细胞仍能低效地执行正常或低于正常细胞功能，不表现临床症状，但此时丧失了系统自身平衡必需的特于正常细胞功能，不表现临床症状，但此时丧失了系统自身平衡必需的特定功能，导致机体定功能，导致机体功能紊乱功能紊乱。 (3) 易致细胞继发感染的组织和器官损伤易致细胞继发感染的组织和器官损伤 某些病毒感染，还易使动物发生继发感染。如马发生流感时，使某些病毒感染，还易使动物发生继发感染。如马发生流感时，使链球菌和其他细菌侵入肺，引发肺炎，而细菌分泌的蛋白酶又能裂解链球菌和其他细菌侵入肺，引发肺炎，而细菌分泌的蛋白酶又能裂解病毒的血凝素，激活病毒的感染；轮状病毒和冠状病毒感染易使肠道

40、病毒的血凝素，激活病毒的感染；轮状病毒和冠状病毒感染易使肠道发生大肠杆菌的继发感染，导致严重的腹泻。发生大肠杆菌的继发感染，导致严重的腹泻。 2、病毒的持续性感染、病毒的持续性感染 多数病毒感染都有程度不等的慢性表现，如犬瘟热病毒感染的某多数病毒感染都有程度不等的慢性表现，如犬瘟热病毒感染的某些犬在急性疾病阶段结束后，病毒在他内能数月或数年持续存在，引些犬在急性疾病阶段结束后，病毒在他内能数月或数年持续存在，引起某些器官的迟发性病理变化。病毒的持续感染在急性症状转轻或转起某些器官的迟发性病理变化。病毒的持续感染在急性症状转轻或转化为亚临床后，还可引起轻微的慢性疾病。化为亚临床后，还可引起轻微的

41、慢性疾病。 (1) 持续性感染的类型持续性感染的类型 持续性感染引起宿主的疾病复发，并能引致免疫病理疾病，还与肿瘤持续性感染引起宿主的疾病复发，并能引致免疫病理疾病，还与肿瘤的形成有关。病毒能在经免疫的动物体内以持续性感染的方式存活，成为的形成有关。病毒能在经免疫的动物体内以持续性感染的方式存活，成为传染源，具有流行病学上的重要性。传染源，具有流行病学上的重要性。 病毒持续性感染可分为三种类型：病毒持续性感染可分为三种类型： 持续性感染持续性感染：发病或不发病，：发病或不发病，感染后持续排毒感染后持续排毒，可发生免疫病理病或肿瘤病。，可发生免疫病理病或肿瘤病。 潜伏感染潜伏感染：又名隐性感染，

42、除非激活，一般：又名隐性感染，除非激活，一般并不能发现感染性病毒并不能发现感染性病毒。 慢性感染慢性感染：传染性病毒在一个很长的临床前阶段：传染性病毒在一个很长的临床前阶段逐渐增多逐渐增多，最终导致缓慢、，最终导致缓慢、渐渐 进性致死疾病进性致死疾病。 3. 病毒感染对免疫系统的损伤病毒感染对免疫系统的损伤 病毒可感染免疫系统的细胞，感染细胞的类型因病毒的种类而异。病病毒可感染免疫系统的细胞，感染细胞的类型因病毒的种类而异。病毒感染免疫细胞导致免疫系统的损伤，从而加重疾病，或使宿主易于再感毒感染免疫细胞导致免疫系统的损伤，从而加重疾病，或使宿主易于再感染另一种病毒，后者称为双重感染。染另一种病

43、毒，后者称为双重感染。本节学习要点：本节学习要点： 1. 细胞培养的概念、类型和方法； 2. 病毒与细胞相互作用的类型； 3. CPE、空斑与包涵体的概念、空斑与包涵体的概念； 4. 病毒的致病机制。第五节第五节 病毒鉴定病毒鉴定一、病料的采集与运送一、病料的采集与运送二、病毒的培养二、病毒的培养三、病毒的纯化三、病毒的纯化四、病毒的鉴定四、病毒的鉴定一、病料的采集与运送一、病料的采集与运送v从动物体内存在病毒最多的器官或组织采取病料。从动物体内存在病毒最多的器官或组织采取病料。v注意采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。注意采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。v检查抗体时，则采取发病初期和恢复

44、期血清，以了解抗体滴度的变化。检查抗体时，则采取发病初期和恢复期血清，以了解抗体滴度的变化。v保存与运送，由于病毒对外界因素特别是很敏感，因此，必须放在保护液中，保存与运送，由于病毒对外界因素特别是很敏感，因此，必须放在保护液中，并在低温下保存或寄送。并在低温下保存或寄送。v收集病料必须无菌操作，如有污染，可用通过滤器、加抗生素或高速离心法收集病料必须无菌操作，如有污染，可用通过滤器、加抗生素或高速离心法除去细菌，方可使用。除去细菌，方可使用。动物接种动物接种鸡胚接种鸡胚接种组织培养组织培养原代细胞培养传代细胞培养三大培养方法三大培养方法器官培养移植培养 细胞培养 二、病毒的培养二、病毒的培养

45、 1010日龄鸡胚结构日龄鸡胚结构鸡胚接种鸡胚接种 细胞培养细胞培养 原代细胞培养原代细胞培养传代细胞培养传代细胞培养三、病毒的纯化三、病毒的纯化 是从病毒感染的宿主机体组织、体液、分泌物或病毒感染的细胞培养物中提取病毒粒子、除去非病毒成分的过程。 沉淀法沉淀法层析法层析法红细胞吸附法红细胞吸附法电泳法电泳法超速离心法超速离心法超滤法超滤法纯化病毒方法纯化病毒方法超滤系统超滤系统超速离心机超速离心机二、病毒的鉴定1 1、病毒的鉴定方法、病毒的鉴定方法 可通过以下方法确证病毒的存在： 形态学观察 检查包涵体 细胞病变 检测某病毒抗原或特异性抗体2、病毒的鉴定过程、病毒的鉴定过程(1) 对病毒宿主

46、范围及感染表现进行鉴定 病毒一般都有自己相当专一的宿主范围和感染表现。(2) 对病毒的理化性质进行鉴定 病毒大小与形态、核酸类型、对理化因子的敏感性。(3) 对病毒的血细胞凝集性质进行鉴定 病毒血凝谱及温度、酸碱度对血凝特性的影响。(4) 对抗病毒血清或病毒抗原进行鉴定 沉淀试验、凝集试验、ELISA、中和试验等。(5) 对病毒的核酸或基因进行分子生物学鉴定 PCR鉴定、PAGE电泳、核酸酶切分析与序列测定等。(1) 病毒感染单位病毒感染单位(IU) 能够引起宿主细胞发生特异性反应的病毒最小剂量能够引起宿主细胞发生特异性反应的病毒最小剂量(2) 病毒效价或毒力病毒效价或毒力 指单位体积病毒悬液

47、的感染单位数目指单位体积病毒悬液的感染单位数目(3) 半数致死量半数致死量(LD50)(4) 半数感染剂量半数感染剂量(ID50)(5) 半数细胞培养感染量半数细胞培养感染量(TCID50)3、病毒的定量指标、病毒的定量指标本节学习要点：本节学习要点： 1. 病毒感染病料的采集与送检； 2. 病毒的培养方法； 3. 病毒的纯化方法； 4. 病毒的鉴定方法、鉴定过程与定量指标。第六节第六节 噬菌体和亚病毒噬菌体和亚病毒一、噬菌体一、噬菌体(bacteriophage, phage) 病毒种类很多，根据病毒寄生的对象可分：病毒种类很多，根据病毒寄生的对象可分： 植物病毒植物病毒 动物病毒动物病毒

48、微生物病毒微生物病毒 噬菌体：噬菌体：是病毒中的一种，一般把侵染是病毒中的一种，一般把侵染细菌、放线菌的病毒叫噬菌体细菌、放线菌的病毒叫噬菌体(把侵染真菌的把侵染真菌的病毒叫噬真菌体病毒叫噬真菌体)。 噬菌体在自然界广泛存在，噬菌体在自然界广泛存在，1995年共报年共报道了道了4000余种。余种。 ( (一一) ) 噬菌体的结构噬菌体的结构以以大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体为例为例头部：头部：廿面体对称结构，由蛋白廿面体对称结构，由蛋白 质衣壳构成，内含一条质衣壳构成，内含一条DNADNA。颈部：颈部：薄盘状，附颈须。薄盘状，附颈须。尾鞘尾鞘：长长95nm, 95nm, 衣壳粒螺旋对衣壳粒螺

49、旋对 称；可伸缩。称；可伸缩。 尾髓尾髓: :中空，中空，DNADNA可由此进入细胞。可由此进入细胞。基板基板: : 六角形盘状物，其上有刺六角形盘状物，其上有刺 突、尾丝。突、尾丝。刺突刺突: : 有吸附功能。有吸附功能。尾丝尾丝: : 有识别吸附功能。有识别吸附功能。大肠杆菌大肠杆菌T4T4噬菌体构造噬菌体构造( (二二) ) 噬菌体的类型噬菌体的类型根据噬菌体与宿主的关系，可分为：根据噬菌体与宿主的关系，可分为： 烈性噬菌体烈性噬菌体(virulent phase)： 指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体. 温和噬菌体温和噬菌体(tem

50、perate phase)： 噬菌体感染细胞后，将其核酸整合到宿主核噬菌体感染细胞后，将其核酸整合到宿主核DNA上，上， 并随宿主并随宿主DNA的复制而进行复制，在一般情况下，不的复制而进行复制，在一般情况下，不 引起寄主细胞裂解的噬菌体。引起寄主细胞裂解的噬菌体。1、烈性噬菌体、烈性噬菌体(virulent phase) 烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段： 即即吸附、侵入、复制、装配和释放吸附、侵入、复制、装配和释放。 将少量烈性噬菌体与大量宿主细胞混合后，将此混合液与将少量烈性噬菌体与大量宿主细胞混合后，将此混合液与4545左右的琼脂培养基左右的琼

51、脂培养基(1%)(1%)在培养皿中充分混匀，然后倒入含底层琼脂培养基在培养皿中充分混匀，然后倒入含底层琼脂培养基(2%)(2%)的平板培养，经数小的平板培养，经数小时至时至1010余小时后，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，可以用肉眼看到一个个透余小时后，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上，可以用肉眼看到一个个透亮不长菌的小圆斑亮不长菌的小圆斑, ,即即噬菌斑噬菌斑(plaque)。 一个噬菌斑一般由一个噬菌体形成，可用于检测、分离和纯化噬菌体。一个噬菌斑一般由一个噬菌体形成，可用于检测、分离和纯化噬菌体。 若将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬菌斑计数，可测知一定体积内的噬菌斑形成若将噬菌体按一定倍数稀

52、释，通过噬菌斑计数，可测知一定体积内的噬菌斑形成单位单位(plaque forming units, pfu(plaque forming units, pfu) )数目，即噬菌体的数量。数目，即噬菌体的数量。噬菌斑噬菌斑(plaque)噬菌斑噬菌斑(plaque)温和噬菌体温和噬菌体(temperate phase)： 指一些噬菌体感染细胞后，将其核酸整合指一些噬菌体感染细胞后，将其核酸整合(附着附着)到宿主的核到宿主的核DNA上，并且可上，并且可以随宿主以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解。的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解。原噬菌体或前

53、噬菌体原噬菌体或前噬菌体(prophase)： 即整合在宿主核即整合在宿主核DNA上噬菌体的核酸。上噬菌体的核酸。 溶原性细菌溶原性细菌(lysogenic bacterium)： 指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖,而不被裂解。而不被裂解。2 2、温和噬菌体与溶源性细菌、温和噬菌体与溶源性细菌溶原性细菌的特点：溶原性细菌的特点： 可稳定遗传：可稳定遗传：子代细菌都含有子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性。原噬菌体，均具有溶原性。 可自发裂解：可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下上脱落下 来，恢复原来的状态，进行大量的复