生物标志物实验ppt-PowerPointPresen

1、实验四实验四 生物标志物实验生物标志物实验水生动物谷胱甘肽转移酶活性测定水生动物谷胱甘肽转移酶活性测定 指导老师：刘汝涛指导老师：刘汝涛山东大学环境科学与工程学院山东大学环境科学与工程学院 目的与要求目的与要求 实验原理实验原理 设备与材料设备与材料3 32 2 步骤与方法步骤与方法 结果与报告结果与报告5 54 41 1（1）了解有机污染物对代谢关键酶谷胱甘肽转移酶活）了解有机污染物对代谢关键酶谷胱甘肽转移酶活 性影响。性影响。（2）掌握谷胱甘肽转移酶酶活性的体外测定方法。）掌握谷胱甘肽转移酶酶活性的体外测定方法。1 12 2 谷胱甘肽转移酶（谷胱甘肽转移酶（GSTs；也叫谷胱甘肽转硫酶）是

2、；也叫谷胱甘肽转硫酶）是细胞质内催化相细胞质内催化相反应起解毒作用的重要酶，具有许多同反应起解毒作用的重要酶，具有许多同工酶。污染物进入体内经过相工酶。污染物进入体内经过相反应后，在谷胱甘肽转移反应后，在谷胱甘肽转移酶的催化下，细胞内还原性谷胱甘肽能结合相酶的催化下，细胞内还原性谷胱甘肽能结合相反应产生反应产生的亲电性中间体，从而生成亲水性的化合物。细胞膜上有的亲电性中间体，从而生成亲水性的化合物。细胞膜上有多种的跨膜运输机制（如通过多种的跨膜运输机制（如通过ATP推动推动GS-X泵）能使这泵）能使这类亲水性的化合物排出细胞，使之进入血液循环并最终以类亲水性的化合物排出细胞，使之进入血液循环并

3、最终以尿液等形式排出体外，从而起到解毒作用。在很多物种中，尿液等形式排出体外，从而起到解毒作用。在很多物种中，谷胱甘肽结合作用是相谷胱甘肽结合作用是相反应的主要形式。反应的主要形式。 GSTs催化的一般反应为：催化的一般反应为： GSH +R-X = GSR + HX 在该反应中，在该反应中，GSTs的主要功能是通过其活性中心增的主要功能是通过其活性中心增加加GSH和亲电性底物的接触机会，然后激活和亲电性底物的接触机会，然后激活GSH上琉基，上琉基，诱导其对底物的发动亲核性攻击从而形成结合产物。诱导其对底物的发动亲核性攻击从而形成结合产物。2 2 迄今的研究表明迄今的研究表明GSTs存在于所有

4、的动物体内，肝脏存在于所有的动物体内，肝脏是脊椎动物种是脊椎动物种GSTs分布的主要场所。鼠肝中的分布的主要场所。鼠肝中的GSTs占占可溶性肝蛋白的可溶性肝蛋白的10，而鱼肝中的，而鱼肝中的GSTs也是可溶性肝也是可溶性肝蛋白的主要成分。蛋白的主要成分。GSTs能被多种的污染物所诱导，如有能被多种的污染物所诱导，如有机氯农药、多环芳烃和多氯联苯等。在哺乳动物中，经机氯农药、多环芳烃和多氯联苯等。在哺乳动物中，经多环芳烃处理后，其肝脏中多环芳烃处理后，其肝脏中GSTs活性比对照组高活性比对照组高1.52.0倍。在不同的水生动物体内倍。在不同的水生动物体内GSTs可被多环芳烃诱导，可被多环芳烃诱导

5、，其活性高于对照组其活性高于对照组2倍。野外研究发现，在同一条河流中，倍。野外研究发现，在同一条河流中，污染段面鱼体内肝脏组织和消化管组织中污染段面鱼体内肝脏组织和消化管组织中GSTs含量和活含量和活性比清洁断面高出性比清洁断面高出34倍。然而，研究也发现倍。然而，研究也发现GSTs活活性活性诱导受环境条件、生物种类和化合物性质的影响，性活性诱导受环境条件、生物种类和化合物性质的影响，存在较大的差异。存在较大的差异。 基于上述原因，用基于上述原因，用GSTs作为生物标志物来指示特定作为生物标志物来指示特定的污染暴露，近年来在生态毒理学的研究中获得了广泛的污染暴露，近年来在生态毒理学的研究中获得

6、了广泛的运用。在本实验中，将采用体内实验的方法，测定水的运用。在本实验中，将采用体内实验的方法，测定水生动物暴露于有机氯农药林丹（生动物暴露于有机氯农药林丹（Lindane）之后，其体）之后，其体内内GSTs酶活性的变化。酶活性的变化。 1器材器材 冷冻离心机（冷冻离心机（Beckman Coulter 22R centrifuge），），酶标仪（酶标仪（Bio-Tek Instruments，INC）pH计，溶解氧计，溶解氧测定仪，电导率测定仪，测定仪，电导率测定仪，96孔板，孔板，1.5mL离心管，水浴离心管，水浴锅，生物冰袋，移液枪（锅，生物冰袋，移液枪（20uL、100uL、1000u

7、L）及对）及对应枪头。应枪头。 2受试生物受试生物 成年雄性的钩虾（成年雄性的钩虾（Gammarus pulex）。从野外采）。从野外采集投放在集投放在 10L的有机玻璃缸中，人工曝气，在的有机玻璃缸中，人工曝气，在 15（1），），12h光照的条件下至少驯养一周，才能进行光照的条件下至少驯养一周，才能进行染毒暴露。驯养期间，用接种了真菌（染毒暴露。驯养期间，用接种了真菌（Cladospurium sp.）发酵）发酵1周的桤木叶（周的桤木叶（Alnus glutinosa L.）喂食。）喂食。3 3 3试剂试剂 1-氯氯-2，4-二硝基苯（二硝基苯（CDNP），还原性谷胱甘肽），还原性谷胱甘肽

8、（GSH），谷胱甘肽转移酶标准品（），谷胱甘肽转移酶标准品（GSTs），苯甲基磺），苯甲基磺酰氟（酰氟（PMSF），），Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），（聚乙二醇辛基苯基醚），EDTA。 4溶液的配制溶液的配制 （1）林丹储存液）林丹储存液 取取50mg林丹固体颗粒，溶于林丹固体颗粒，溶于500mL的丙酮中配制成的丙酮中配制成100mg/L的林丹储存液，于的林丹储存液，于4下阴暗处密封保存备用。下阴暗处密封保存备用。3 3 （2）酶和缓冲液）酶和缓冲液 配置配置pH=6.5，0.02M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（PB） 利用此磷利用此磷酸缓冲液配制下面三种实验缓冲液：酸缓冲液配制下

9、面三种实验缓冲液： （i）组织破碎缓冲液（）组织破碎缓冲液（HB）：含有：含有1.0Triton X-100（v/v）和）和1.0PMSF（v/v）的磷酸缓冲液；）的磷酸缓冲液； （ii）冲洗缓冲液（）冲洗缓冲液（DB）：含有：含有1.0PMSF（v/v）的）的磷酸缓冲液；磷酸缓冲液； （iii）空白缓冲液（）空白缓冲液（BB）：含有：含有0.1Triton X-100（v/v）和）和1.0PMSF（v/v）的磷酸缓冲液。）的磷酸缓冲液。 100mmol/L PMSF溶液溶液 用用95乙醇溶解适量的乙醇溶解适量的PMSF，于阴暗处保存，于阴暗处保存，-20可保存一个月，可保存一个月，-4可保存

10、可保存5d。3 3 40mmol/L CDNB溶液溶液 用用95乙醇溶解适量的乙醇溶解适量的CDNB，保存方法与，保存方法与PMSF相同。相同。 20mmol/L GSH标准液的配制标准液的配制 配制配制100mmol/L EDTA母液，用母液，用0.1mol/L KH2PO4稀释母液至稀释母液至EDTA的浓的浓度为度为1mmol/L。在。在1mmol/L的的EDTA溶液中加人适量溶液中加人适量GSH使其终浓度为使其终浓度为20mmol/L。用。用1mol/L HCl或或1mol/L KOH校正校正pH。于阴暗处保存，。于阴暗处保存，-20可保存一个月，可保存一个月，-4可保可保存存5d。 酶

11、活测定液酶活测定液 实验之前配制，将实验之前配制，将CDNB和和GSH溶液溶液从冰箱中取出，置于室温。取从冰箱中取出，置于室温。取5份的份的20mmol/L GSH标准标准液、液、9份的磷酸缓冲液（份的磷酸缓冲液（pH=6.5，0.02mol/L）和）和1份的份的40 mmol/L CDNB溶液，充分混合，配制成酶活测定液。溶液，充分混合，配制成酶活测定液。3 3 1暴露试验暴露试验 按照急性毒性试验方法，将雄性的成年钩虾分别暴按照急性毒性试验方法，将雄性的成年钩虾分别暴露于梯度林丹浓度中。暴露温度设定在露于梯度林丹浓度中。暴露温度设定在151，光，光暗比为暗比为12h12h。实验开始时测定各

12、浓度梯度林丹曝。实验开始时测定各浓度梯度林丹曝气水的溶解氧，气水的溶解氧，pH和电导率。和电导率。 暴露暴露48h后，将存活的个体从容器中打捞出来，先后，将存活的个体从容器中打捞出来，先用吸水纸将表面的水分吸干之后，然后放入用吸水纸将表面的水分吸干之后，然后放入1.5mL的聚的聚乙烯离心管中（每管一只）。将这些离心管的放入液氮乙烯离心管中（每管一只）。将这些离心管的放入液氮罐罐20s以猝死钩虾。取出的离心管在以猝死钩虾。取出的离心管在-70保存。保存。4 4 2酶活力的测定酶活力的测定 将将1.5 mL离心管从超低温冰箱中取出，加入离心管从超低温冰箱中取出，加入100uL的冷的组织破碎缓冲液（

13、的冷的组织破碎缓冲液（pH=6.5）。捣碎研磨管内的钩）。捣碎研磨管内的钩虾虾2030min，加入，加入9uL冷的冲洗缓冲液冷的冲洗缓冲液DB（pH=6.5）。）。4下下14000g离心离心3min，取，取100uL的上清。将此上清移的上清。将此上清移另一置于生物冰袋上的离心管中。往新的离心管内加入另一置于生物冰袋上的离心管中。往新的离心管内加入900uL空白缓冲液空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀，待用。）后充分混匀，待用。 在一个干净的在一个干净的1.5mL的离心管内加入的离心管内加入500uL酶活为酶活为 1.4单位单位/mL的谷胱甘肽转移酶标准样品，加入的谷胱甘肽转移酶标准样品，

14、加入500uL的的冷的空白缓冲液冷的空白缓冲液BB（pH=6.5）后充分混匀。）后充分混匀。4 4 在在96孔板中加入孔板中加入50uL的的GST标准样品，钩虾组织液上清标准样品，钩虾组织液上清或者空白缓冲液（或者空白缓冲液（BB），每组设四个平行。然后加入），每组设四个平行。然后加入150uL酶活测定液，使每个孔内含有酶活测定液，使每个孔内含有200uL的反应液。将的反应液。将96孔板放入孔板放入酶表仪酶表仪30轻微震荡反应轻微震荡反应30min，然后充分震荡，然后充分震荡96孔板以混合孔板以混合各反应液。各反应液。340nm下每隔下每隔1min记录一个吸光值，计算吸光值记录一个吸光值，计算

15、吸光值随时间的变化的斜率。随时间的变化的斜率。 式中：式中：OD为吸光值随时间变化的斜率（为吸光值随时间变化的斜率（OD340/min）；）；为摩尔吸光系数（为摩尔吸光系数（9600mol-1cm-1）；）；R为反应系统体积为反应系统体积（uL）；）；S为样品上清的体积（为样品上清的体积（uL）；）；W为样品蛋白浓度为样品蛋白浓度（g/L）；）； P为样品厚度（为样品厚度（0.6cm）。）。4 4GST酶活酶活PWR1000ROD 3总蛋白的测定总蛋白的测定 以牛血清蛋白为校正标准，用以牛血清蛋白为校正标准，用Bio-Rad公司的试剂盒公司的试剂盒检测定钩虾组织破碎液中的蛋白质浓度。将牛血清蛋

16、白溶检测定钩虾组织破碎液中的蛋白质浓度。将牛血清蛋白溶于磷酸缓冲液（于磷酸缓冲液（pH=6.5）中，配制成）中，配制成200mg/L的蛋白标准的蛋白标准液。取液。取 0mL、0.25mL、0.75mL、1.00mL和和1.35mL该蛋该蛋白标准液，先加入白标准液，先加入8mL磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH=6.5），再加入空），再加入空白缓冲液白缓冲液BB（pH=6.5），配制成浓度依次为），配制成浓度依次为0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL和和25.0mL的蛋白标的蛋白标准液系列。从每个浓度的蛋白标准液中取出准液系列。从每个浓度的蛋白标准液中取出800uL至干净至干净

17、的的EP管中，加入管中，加入200uL Bio-Rad产品。稀释缓冲液取产品。稀释缓冲液取80uL的虾组织液上清至一个干净的的虾组织液上清至一个干净的EP管中，加入管中，加入80uL的的 0.1的的Triton X-100，用，用640uL磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH=6.5）稀）稀释混合液至释混合液至800uL，加人，加人200uL Bio-Rad产品。产品。4 4 从上述的反应体系中取出从上述的反应体系中取出200uL和和Bio-Rad反应过反应过的蛋白液（钩虾组织破碎液上清，牛血清蛋白），每组的蛋白液（钩虾组织破碎液上清，牛血清蛋白），每组设三个平行，加入设三个平行，加入96孔板内。孔板内。25下，摇动下，摇动96孔板孔板20s后，用酶标仪测定后，用酶标仪测定620nm下的吸光度。根据牛血清蛋白下的吸光度。根据牛血清蛋白标准液的读数汇出标准曲线，计算出曲线的斜率标准液的读数汇出标准曲线，计算出曲线的斜率K。 式中：式中：OD620为待测样品为待测样品620nm下的吸光度；下的吸光度；K为为牛血清蛋白标准样曲线的斜率。牛血清蛋白标准样曲线的斜率。4 4KOD620蛋白浓度蛋白浓度5 51.急性毒性试验结果记录急性毒性试验结果记录曝气水曝气水空白空白溶剂组溶剂组对照对照林丹林丹1u