Ion torrent De novo测序文库构建方法 De-novo library

1、De novo测序文库构建方法一、De novo测序的原理De novo测序不需要任何参考序列，即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、微生物的全基因组序列，从而推进该物种的研究。De novo测序没有参考序列，需要建立不同片段大小及类型的测序文库，测序后的信息需要组装和拼接。拟构建200bp和400bp Ion测序文库，以及Ion mate-pair测序文库。二、文库构建技术路线1. Ion 200 or 400-base-read libraryWorkflow基因组DNA提取OD260/28

2、0检测，凝胶电泳检测，基因组大小评估，基因组定量超声波打断末端修复 片段纯化接头连接 纯化文库片段筛选（E-Gel胶回收）文库片段扩增 纯化Agilent检测，Qubit定量OneTouch、ES上机测序2. Ion mate-pair library基因组DNA提取基因组定量检测DNA破碎（HydroShear DNA Shearing Device）（压力挤压破碎大片段DNA）末端修复文库片段选择（凝胶电泳，SOLiD凝胶回收试剂盒纯化）文库片段定量MP接头连接（SOLiD MP接头连接试剂盒） 纯化Qubit定量确定DNA回收量，确定回收到的片段含量（含量不同，使用的试剂量不同）DNA片

3、段环化分离纯化环状DNA定量环化DNA缺口修复及SOLiD文库试剂盒纯化T7核酸外切酶、S1核酸酶 酶切 纯化末端修复文库片段于链霉素亲和素微珠相连连接Ion接头缺口修复、与扩增凝胶条带检测（确定循环数）片段扩增 SOLiD试剂盒纯化片段切胶回收Agilent检测Q-PCR定量文库构建完成三、文库构建用到的试剂盒Ion Library Adaptors and Primers and 5500 SOLiD Mate-Paired Library KitMate-Paired Library Enzyme ModuleMate-Paired Library Amplification Modul

4、eMate-Paired Library Oligo moduleLibrary Micro Column Purification KitAgencourt AMPure XP 60 mL KitQubit 2.0 Fluorometer及相应的试剂Agilent 2100 及相应的试剂四、400bp测序文库构建步骤1.细菌基因组DNA的提取要求客户提供足量菌体。将培养至对数期的菌液分装到2-3支2mL离心管，采用适当的转速离心使菌体沉淀到管底，除去上清液，迅速放入液氮速冻后，放入装有干冰的保温盒内运送。细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。取对数生长期的菌液，

5、按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。2.DNA片段化采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断步骤：1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1g2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色3）将待打断DNA装入Ep LoBind

6、管中，其中DNA为100ng或1g，加入Low TE至总体积为50mL4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中，转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子5）选择Ion_Torrent_400bp_50L_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN”6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中3.末端修复及接头连接3.1 末端修复使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s步骤：1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79L2）向体系

7、中加入20L 5×末端修复buffer，1L末端修复酶，总体积为100L3）室温放置20min3.2 片段纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤：1）加入180L Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min2）瞬时离心后，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500L 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心

8、除去上清4）重复第三步5）用20L墙头小心吸去多余的液体6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入25L Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）9）纯化的DNA片段用于下一步的接头连接4.接头连接、缺口修复和纯化片段两端的接头分别为barcode接头和P1接头4.1 接头连接在0.2mL体系中加入（以100ngDNA为例）DNA 25L10×Ligase Buffer 10LIon P1 Adaptor 2LI

9、on Xpress Barcode X+ 2LdNTP Mix 2LNuclease-free water 49LDNA Ligase 2LNick pair polymerase 8LTotal 100L将体系配置好后，放入PCR仪按照下面的温度进行1个循环扩增25 15min72 5min4 hold循环×1立即转移至一个新的1.5mL离心管中4.2 纯化片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行步骤：1）加入140L Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min2）瞬时离心后

10、，将离心管放置于磁力架（如DynaMag-2磁力架）3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上3）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500L 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，使磁珠悬浮，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清4）重复第三步5）瞬时离心，用20L墙头小心吸去多余的液体6）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min7）取下离心管，加入20L Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合8）瞬时离心后，将离心管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）5.文库片段筛选方

11、案1E-Gel Agarose System采用E-Gel SizeSelect 2% Agarose Gel，在E-Gel电泳、成像系统中按照操作说明进行。主要步骤：1. 上胶 将E-Gel系统包含的2%Agarose凝胶安装到基座上2. 点样 胶孔内加入250ng的DNA Ladder、1g DNA文库3. 电泳 打开电源，设置电泳时间，开始电泳4. 片段回收 根据Ladder选择需要回收的片段切胶回收5. 片段纯化方案2采用琼脂糖凝胶电泳，胶回收法步骤：制备1%琼脂糖凝胶1）称取0.7g琼脂粉置于锥形瓶中，加入70mL 1×TAE2）锥形瓶放置于微波炉中加热至融化，取出，将融化

12、的凝胶转移至凝胶区专用的100mL小烧杯中，向小烧杯中加入35L 0.5L/mL的EB（或其他染色物，如goldview，duRed等，使用浓度和用量各不相同）3）将染液充分混匀，倒入装有制胶板且插上了梳子的胶槽中，待凝胶冷却后，轻轻拔下梳子，将装有凝胶的制胶板放入到电泳槽中，其中电泳槽内装有1×TAE缓冲液，没过胶约12mm4）加样。向装有20L的片段化DNA离心管中加入2L的6×loading buffer，将离心管内的DNA溶液转移到胶孔中，同时在于凝胶间隔的位置点入35L DL 1000 marker5）120V电泳1520min，蓝色条带到距离另一侧边缘12cm时

13、停止电泳6）将凝胶放置到切胶仪上，在紫外灯下迅速将400bp左右的片段切胶回收7）使用胶回收试剂盒，按照说明书操作步骤，实现400bp左右大小文库片段的筛选6.文库片段扩增6.1 100ng文库PCR体系扩增采用Ion Plus Fragment Library Kit体系包括：Platinum PCR SuperMix High Fidelity 100LLibrary Amplification Primer Mix 5L文库片段 25L Total 130L放入PCR仪中，按以下循环进行：95 5min95 15s58 15s 8个循环70 1min4 hold6.2 扩增产物纯化1）体

14、系中加入195L Agencourt AMpure XP Reagent2）上下震荡5次，瞬时离心后室温放置5min3）将离心管放置于DynaMag-2磁力架3min，至溶液澄清，小心去除上清，离心管保持放置在磁力架上4）离心管放置于磁力架上不移动，配置新的500L 70%乙醇，加入，30s后，盖上盖子颠倒混匀2次，放回磁力架至溶液澄清后，小心除去上清5）重复第四步6）瞬时离心后，放置于磁力架上，用20L墙头小心吸去多余的液体7）将离心管留在磁力架上，室温风干不超过5min8）取下离心管，加入20L Low TE缓冲液，盖上盖子，上下颠倒混匀5次，旋窝震荡10s，充分混合9）瞬时离心后，将离心

15、管放于磁力架上至少1min，溶液澄清后，将上清移入一支新的1.5mL EP管中（不可吸到磁珠）10）将转移的离心管放置到磁力架上至少1min，将上清液小心转移到一支新的1.5mL离心管中7.Agilent Test & Qubit Qualify片段大小在400bp左右，片段浓度不低于1L/mL五、Ion Mate-Pair文库构建步骤1.细菌基因组DNA提取、检测2.DNA片段化使用HydroShear DNA Shearing Device对基因组DNA进行片段化处理，将DNA断裂为3kb或10kb大小的片段。原理：通过压力作用，使DNA通过中间的孔口，使之断裂步骤：1）3kb片段

16、 在一支1.5mL离心管中加入5L DNA和150L无核酸酶水 5kb 片段 在一支1.5mL离心管中加入20LDNA和150L无核酸酶水2）在Edit Wash Scheme Tab上，进行以下设置2轮WS1（0.2N HCl）2轮WS2（0.2N NaOH）3轮无核酸酶水处理3）设置完仪器参数，运行片段化程序4）运行清洗程序5）使3kb DNA文库总体积小于70L，10kb DNA文库总体积小于100L3.末端修复（以3kb文库为例）按照以下体系配置DNA 片段 67L5×Reaction Buffer 20L10 mM dNTP 4.0LEnd Polishing E1 4.0

17、LEnd Polishing E2 5.0LNuclease-free Water variesTotal 100L室温下（25-30）放置30min向体系中加入20% SDS 8.5L10×BlueJuice Gel Loading Buffer 10.0L65水浴10分钟冰上放置5分钟后，加入胶孔中进行琼脂糖凝胶电泳4.片段切胶回收使用1%琼脂糖凝胶分离3kb片段文库，使用0.6%琼脂糖凝胶分离10kb片段文库。使用1×SYBR Safe Gel染色剂，1×TAE buffer1×TAE 200mLAgarose 2g for 1% gel and

18、1.2g for 0.6% gel10000×SYBR Safe gel stain 20LTotal 200mL低电压（5v/cm）电泳过夜切胶回收1）在Safe Imager蓝光底座上切胶。3Kb片段选取ladder 2.8-3.5kb的片段，10kb片段选取Ladder 10-11kb片段。如果胶块体积过大，切成小块。2）使用SOLiD Library Quick Gel Extraction Kit进行片段回收纯化胶块200mg，使用1.5mL离心管溶胶步骤a.向离心管内加入30L Gel Solubilization Buffer(L3) /每10 mg凝胶b.混匀，震荡，

19、室温下静置15min，待凝胶溶解（不可高温水浴）c.按照每10mg凝胶加入10L异丙醇的比例，向体系中加入异丙醇3）按照每支分离柱分离400mg凝胶的量，或者分离小于2000L混合液的比例，将上述混合液加入到分离柱上，室温下12000r/min 离心1分钟，弃去液体，将柱子放到离心管中4）洗柱子向柱子中加入500L Wash Buffer（W1），12000r/min 室温离心1min，弃去液体，开盖离心2分钟，除去多余的乙醇5）收集DNA将柱子转移到一支新的1.5mL离心管，加入50L Elution Buffer，室温下放置10分钟后，12000r/min 室温离心1分钟，离心管中包含纯化

20、的DNA片段5.片段定量使用Qubit 2.0对纯化的DNA片段进行定量6.DNA与MP接头连接6.1.计算需要加入的接头量Y（L）：Y=106/660/平均片段长度×DNA质量（g）×50/25 =106/330×DNA质量（g）/平均片段长度如Y1L，则加入1L接头到体系中6.2 体系末端修复的DNA 60L5×Reaction Buffer 20LMPR Adaptor (ds), 25M YLMPL Adaptor (ds), 25M YLT4 DNA聚合酶，5U/L 10L无核酸酶水 VariableTotal 100L室温下放置30min6.

21、3片段纯化6.3.1制作磁珠悬液样品溶液 100L无核酸酶水 150LAgencourt AMPure XP Reagent 200LTotal 450L旋窝震荡混匀15s，瞬时离心室温（20-25）下，放置5min将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清液6.3.2 将结合有DNA的磁珠清洗两遍，过程中保持装有磁珠的离心管在磁力架上 加入600L 70%乙醇于离心管中，不震荡磁珠 保持离心管在磁力架上至少1min，小心除去上清6.3.3 将离心管从磁力架上取下，瞬时离心后，将离心管放回磁力架，使用20L小枪头除去上清液6.3.4 打开离心管盖，室温（20-25）风干不超过3m

22、in6.3.5 洗脱DNA将离心管从磁力架上取下，加入50L Elution Buffer（E1）旋窝震荡15s，瞬时离心，室温下（20-25）放置3min将离心管再次放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清将上清液转移到一支新的1.5mL LoBind离心管6.4 Qubit定量分析如果纯化的DNA含量初始DNA总量的5%，则可进入下一步。如果纯化的DNA含量初始DNA总量的5%，也可进入下一步，但在后续的纯化步骤中为了最小化地减少DNA损失量，应该重新确认一开始DNA片段的长度，建议增加或减少10%的插入片段长度。如果纯化的DNA含量小于50ng，重新开始DNA样品的定量以及mate-pai

23、r文库构建初始步骤。7.通过分子内杂交环化DNAMate-paired接头包括一个阻塞寡核苷酸来保护3端MP接头自连接。环化时，热变性使阻塞寡核苷酸移除。DNA分子内杂交环化必须在低浓度条件下进行。7.1 加热块中所有的孔中都加入水，预热至707.2 计算环化反应的总体积（L），因此根据已知的DNA浓度和体积，将最终的浓度定量为0.5ng/LT=DNA×V/0.5如：DNA=5ng/L，V=50L，则T=500L7.3 体系DNA vL10×Plasmid-Safe Buffer T/10.0LNuclease-free Water T-（T/10）-VLTotal TL7

24、.4 将体系放置到加热模块中70，5min，然后将体系放置到冰上，3kb体系5min，10kb体系30min8.分离环化DNA使用Plasmid-Safe DNase除去非环化DNA。处理过后，使用Agencourt AMPure XP Reagent进行纯化8.1 配置下面的反应体系，其中T为环化DNA的总体积环化DNA体积TLATP，100mMT/100LPlasmid-Safe DNase，10 U/LT/100L混合反应液，37保温40min8.2 片段纯化8.2.1 使Agencourt AMPure XP Reagent 磁珠再悬浮8.2.2 将DNA结合到磁珠上a. 准备磁珠样品

25、体积 TL磁珠稀释buffer 0.7×TLAgencourt AMPure XP Reagent 0.3×TLb. 旋窝震荡15s后，瞬时离心c. 室温下（20-25）放置5mind. 将磁珠放置到磁力架上1min以上，至溶液澄清，小心除去上清8.2.3 洗涤DNA2次，每次洗涤时，将离心管放置到磁力架上a. 向体系中加入600L 70%乙醇，不混动磁珠b. 将离心管保持在磁力架上至少1min，小心除去上清8.2.4 将离心管取下，瞬时离心后，放回到磁力架上，用20L枪头小心除去上清8.2.5 打开管盖，室温（20-25）下放置3min8.2.6 混合无核酸酶水84LNi

26、ck Translation Buffer 10.0L8.2.7 洗脱DNAa.将离心管从磁力架上取下，加入91L Nick Translation Buffer的pre-mixed solution于装有DNA的离心管中b.轻轻混合15s，瞬时离心，然后室温下放置3minc.将离心管放置到磁力加上至少1min，至溶液澄清d.将上清转移到一支新的0.2 mL PCR管中注意：立即进行下一步骤定量：如果3kb文库的初始DNA量为1-2g，10kb文库的初始DNA量小于15g，则跳过定量步骤，立即进行下一步操作。否则，使用Qubit 2.0进行定量。9.环化DNA缺口转化使用E.coli DNA聚

27、合酶将环化DNA缺口转化为基因组DNA区，环化目标区域大小可通过反应温度和时间控制。为了方便实验步骤，不同的mate片段大小采用不同的反应时间但相同的反应速度进行。9.1 环化DNA缺口转化注意点：DNA聚合酶对温度变化敏感，因此在反应前先将DNA聚合酶放置到5条件下数分钟a. 向0.2mL PCR管中加入以下组分DNAse-treated，纯化DNA90L10 mM dNTP5.0Lb. 混合体系后，瞬时离心c. 将体系放置到PCR仪上5，2-3min，不加入DNA聚合酶，不打开热盖d. 在另一支0.2mL离心管中加入5.0L DNA聚合酶，瞬时离心e. 将DNA聚合酶放置到PCR仪上5，大

28、于1min，不打开热盖f. 计时器设置10ming. 将DNA聚合酶混合到体系中，轻轻吹打混匀，瞬时离心，放回到PCR仪中h. 开始计时i. 准备400L含异丙醇的 Binding Buffer（B2-S）于一支1.5mL离心管中j. 0.2mL离心管混合体系孵化结束后，立即将混合液转移至1.5mL包含Binding Buffer的离心管中，Binding Buffer能使酶失活，终止反应。9.2 使用SOLiD柱式文库纯化试剂盒纯化DNA9.2.1 将空柱子放置到离心机上10000r/min，预离心1min，离心后的柱子盖子关闭9.2.2 将DNA装到分离柱上a. 将缺口转化的DNA和混有异

29、丙醇的Binding Buffer充分混合b. 将所有的混合液加入到分离柱上c. 室温下10000 r/min离心1min，取出液体，环化DNA保留在柱子底部9.2.3 洗涤分离柱a. 将分离柱放回到原先的离心管中b. 加入650L 加入乙醇的Wash Buffer（W1）于分离柱中c. 室温下10000 r/min离心1min，弃液体d. 14000 r/min 离心除去剩余的洗脱液9.2.4 洗脱DNAa. 将分离柱转移到一支新的1.5mL离心管b. 加入25L Elution Buffer（E1）于分离柱正中心，将DNA洗脱，保持分离柱竖直1minc. 室温下14000 r/min离心1

30、mind. 将离心的液体重新加入到分离柱上，保持分离柱竖直1mine. 室温下14000 r/min离心1min9.2.5 必要时，将纯化的DNA转移到一支新的1.5mL LoBind离心管中10. 使用T7核酸外切酶和S1核酸酶对DNA进行酶切10.1 使用T7核酸外切酶进行酶切10.1.1 体系DNA25L10×Buffer45.0LT7 核酸外切酶2.0L无核酸酶水18.0LTotal50L10.1.2 将体系混合后37温浴15min10.1.3 将体系放置到70下20min，使T7核酸外切酶失活10.1.4 冰上放置5min10.2 S1核酸酶处理10.2.1 使用S1 Nu

31、c Dilution Buffer对1.0L 50U/L S1核酸酶稀释10.2.2 体系DNA50L3M NaCl1.7LS1 Nuclease2.0L Total53.7L10.2.3 37温浴15min10.3 使用Agencourt AMPure XP Reagent纯化DNA10.3.1 将Agencourt AMPure XP Reagent磁珠再悬浮10.3.2 DNA于磁珠结合a. 体系：反应样53LAgencourt AMPure XP Reagent95LTotal148Lb. 旋窝混匀15s，瞬时离心c. 室温下（20-25）放置5mind. 将离心管放置到磁力架上至少1

32、min，至溶液澄清10.3.3 洗涤DNA 2次，每次洗涤时，保持离心管始终在磁力架上a. 加入600L 70%乙醇于离心管中，不搅动磁珠b. 保持1min后，小心除去上清10.3.4 将离心管从磁力架上取下，瞬时离心后，放回磁力架，使用20L离心管小心除去上清液10.3.5 打开离心管盖，室温下放置3min使磁珠干燥10.3.6 洗脱DNAa. 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入50L Elution Buffer（E1）b. 震荡混匀15s，瞬时离心，室温下（20-25）放置3minc. 将离心管放回磁力架至少1min至溶液澄清d. 将上清转移到一支新的1.5mL LoBind离心管1

33、1. DNA片段末端修复11.1 将以下组分混合进行末端修复T7/S1 酶切DNA50L5×Reaction Buffer20.0L10mM dNTP Mix2.0LEnd Polishing Enzyme 22.0LNuclease-free Water26LTotal100L11.2 混合液室温下放置30min（在此期间可以进行下一步的磁珠预洗步骤）11.3 向体系中加入5.0L 0.5M EDTA，终止反应体系Stopped end-repair mix105LBead Binding Buffer200LNuclease-free Water95LTotal400L12. 文

34、库片段与链霉素亲和素磁珠结合12.1 磁珠准备12.1.1 准备1×BSA 缓冲液100×BSA5.0LNuclease-free Water 495LTotal500L12.1.2 旋窝震荡Dynabeads MyOne Streptavidin C1的离心管，取50L磁珠装入一支1.5mL LoBind离心管中12.1.3 加入500L Bead Wash Buffer于50L磁珠体系中，旋窝混匀15s，瞬时离心12.1.4 将磁珠放置到磁力架上至少1min至溶液澄清，小心除去上清12.1.5 加入500L 1×BSA，旋窝震荡15s，瞬时离心12.1.6 将

35、离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，小心除去上清12.1.7 加入500L Bead Binding Buffer，旋窝震荡15s，瞬时离心 注意：第八步在DNA末端修复结束后进行12.1.8 将离心管放置到磁力架上至少1min，至上清澄清，除去上清12.2 将文库DNA于磁珠连接12.2.1 将含有Bead Binding Buffer的400L文库DNA加入到准备好的磁珠中，旋窝震荡15s12.2.2 室温下（20-25）放置30min后，瞬时离心12.3 洗涤DNA-磁珠混合体系12.3.1 准备1×Reaction Buffer5×Reaction Buf

36、fer120LNuclease-free Water480LTotal 600L12.3.2 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，小心除去上清12.3.3 洗涤磁珠三次：a. 向体系中加入500L Bead Wash Buffer，旋窝震荡15s，瞬时离心b. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，小心除去上清12.3.4 洗涤再悬浮磁珠a. 加入500L 1×Reaction Buffer，旋窝混匀15s，瞬时离心b. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，小心除去上清c. 将磁珠在87L 1×Reaction Buffer中悬浮13. 连

37、接Ion接头13.1 Ion接头于DNA-磁珠复合体连接a. 体系DNA-bead 复合物87LIon Library Adaptor Mix3.0LT4 DNA连接酶，5U/L10.0LTotal100Lb. 室温下旋转混合30minc. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清液13.2 洗涤DNA 3次a. 向离心管中加入500L Bead Wash Buffer，旋窝震荡15s，瞬时离心b. 将离心管放置到磁力架上至少1min，溶液澄清后，除去上清13.3 洗涤、再悬浮DNA-磁珠复合体a. 向体系中加入500L Elution Buffer（E1），旋窝震荡15s，瞬

38、时离心b. 将离心管放置到磁力架上至少1min，至溶液澄清，除去上清c. 加入30L Elution Buffer（E1）使DNA-磁珠复合体再悬浮14. 缺口修复和文库预扩增14.1 配置与扩增PCR体系连接接头且纯化的DNA通过PCR过程完成缺口修复，使用Platinum PCR Amplification Mix进行。接下来，使用Ion Amplification Primer Mix以及Platinum PCR Amplification Mix对文库进行预扩增。预扩增是用来决定用于最终扩增的循环数，避免过多的扩增循环。选择适当的扩增循环数，使用2% E-Gel EX凝胶电泳时，扩增片段恰好可见。14.1.1 准备PCR扩增体系组分Platinum PCR Amplification Mix70LIon Library Amplification Primer Mix2.5LTotal72.5L14.1.2将体系旋窝混合，瞬时离心，对照管向其中加入23L PCR反应体系混合液，标号“PCR #0”14.1.3 将4.0L DNA-磁珠复合物加入到49.8L PCR反应混合体系反应液中，旋窝震荡混匀，然后分为2管（约25L），标号PCR 1#、PCR 2#14.1.4 使用两个不同的PCR仪按照下面的循环数运行样