广州大学生物工程下游技术实验(超氧化物歧化酶SOD)资料

1、生物工程下游技术实验“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术”姓名： 学号：指导老师：柯德森； 同组者：； 时间: 摘要： 通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力不断减小，比活力不断上升，总纯化倍数为1.03，活性得率为8.92%。一、 前言 超氧化物歧化酶(superoxide dsdismutase，SOD)是需氧化物中以超氧阴离子为底物的一种酶，广泛存在于各种生

2、物中。SOD不仅在生物体内对抗氧化、解毒起重要作用，也有延缓机体衰老、抗肿瘤及抗免疫性疾病等功能，因而受到极大关注。SOD属于金属酶，其理化性质不仅取决于蛋白质部分，而且还取决于结合到活性部位的金属离子。按照结合的不同金属离子，生物体中SOD有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和FesOD三种，但近几年发现低等生物中尚存在含Ni的SOD。在已发现的酶中，超氧化物歧化酶 (SOD)是需氧生物和耐氧生物的体内清除超氧化物自由基的酶超氧 自由基在体内的过多积累将可能引发脂质过氧化损伤DNA，使脱水酶失活，使线粒体中的NADH脱氢酶NADH氧化酶磷酸腺苻酶 (ATPase)失活，从而易引起生物体发疾病或

3、衰老。自从1968年McCord与Fridovich发现 SOD及其催化超氧化物自由基歧化为 O2 与H2O以来，SOD一直以來被认为是生物体内最重要的抗氧化酶。根据近10年的研究报告表明，SOD具有清除超氧化物自由基，防止其对机体直接或间接的损伤；使O2成为细胞内自由基的排污漕；调节机体内O 的水平；调节机体内NO水 和催化反应产物H2 O2等作用。现在在日常生产应用中，多以动物血液中提取SOD。但是动物血液中的疾病很多，价格也比较昂贵。从植物中提取SOD就可以相应的解决上述问题，类似绿豆芽这种植物，其成本低廉，且SOD的含量丰富，又无污染，将其大量应用于生产有着很好的发展前景。本实验以绿豆

4、为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用。<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100或G150）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000, 考马斯蓝G250 , 磷酸 ，乙醇（AP） ， 牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), 甲硫氨

5、酸( methionine) , NBT（氮兰四唑 Nitroblue Tetrazdinna）, 核黄素 , EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）, <三>仪器:离心机WFZ-UV2000 型紫外分光光度计201×7（717）强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂 匀浆机、各型号烧杯、试管、量筒、带毛塞试管、漏斗、移液枪、移液管、玻璃棒等<四>实验方法和步骤：1材料处理和取样1）25g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，加入250 ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量样为样，进行SOD活

6、性测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）2）实验流程：1. 称量25g 绿豆+250ml pH7 0.05 mol/L pb液，匀浆，两层纱布过滤，离心（3000rpm）15Min 取清液，取少量样为样，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。2. 所得清液测量总体积，缓慢40饱和（NH4）2SO4 至浓度为19.4g/100ml，4冰箱静置分层。3. 离心（3000rpm） 取清液，取少量为样，测量SOD活性、蛋白质含量测量，计算SOD总活性单位及活性单位。4. 步骤3中的清液缓慢加入硫酸铵至75%饱和度（8.7g/100ml）（过程充

7、分搅拌），5至分层，离心（3000rpm） 取沉淀，取样，计算SOD总活性单位及活性单位。5. 装入透析袋中，于蒸馏水中5透析过夜。6. 透析后溶液用滤纸过滤得清液，重新装入透析袋中用PEG浓缩。7. 装柱：1）排气泡 加蒸馏水 留15体积水2）100mL G100 一次装完 3）静置10min 打开出液口 排过量洗脱剂 4）保留离胶面23cm 接洗脱瓶 平衡30min 理想流速注意 胶面始终保持水层 洗脱瓶：pH7, 0.02MPb8. 层析过程样品：浓缩液 离心 过滤 体积31mL 取样上样：5上样量23mol洗脱:1mL/min,3mL/支，共收100120mL *测（1）A280值 （

8、2）SOD活性（粗略） 20支管 每支3mL （3）搜集活性峰并测酶活性2植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量1）连苯三酚法测定SOD活性： 溶液配制：1， 连苯三酚：630 mg-®100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。共配500ml.2， pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl： A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-1000 ml (储备液)B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储备液)0.05mol

9、/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-定容到1000ml.操作：25°C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 ml 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每秒测一次值，自氧化速率的变化（D）控制在0.07 min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（D），酶量的加入控制在使加样后的D在0.035/min左右。（以上DD的变化值不需特别严格，D只要控制在0.1以下0.04以上，D变化

10、在D的约一半左右即可）3考马斯蓝G-250测蛋白的方法：实验器材:分光光度计,试管及试管架,比色皿,移液管;移液枪实验材料与试剂:l 考马斯亮蓝G-250 (0.01%, W/V): 100mg 考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%的乙醇中,加入100ml 85% 的磷酸,将溶液用水定容到1000 ml,过滤得清液于棕色瓶中备用.l 标准蛋白质溶液:牛血清蛋白(BSA)用蒸馏水配成0.1mg/mll 待测样品液:S1,S2 (3颗绿豆10ml水-研磨-离心2500rpm得清液),S3,S4为原液稀释10倍（S1S2S3S4均为样品体积，S3和S4不一定做，在未知样品蛋白含量时可先设计一个浓度

11、梯度以保证测量值在标准曲线的线性范围内）操作方法:1. 牛血清蛋白标准曲线的制作:按下表加入试剂,混匀静置2分钟,以1号管为空白调零点,测下各管的A595值,以吸光值(A595)为纵坐标,每管蛋白质含量为横坐标作出标准曲线.试管号123456S1S2S3S4标准蛋白/µl0100200300400500样品体积/µl5010050100每管中蛋白含量/(µg)01020304050水/ul5004003002001000450400450400G-250染色液/ml3333333333室温静置2minA5952. 样品蛋白质含量测定:取未知浓度的蛋白质(通过适当稀

12、释使其浓度控制在测量有有效范围内),加到试管内,再加入G250染色液3ml混匀,测其595nm下的吸光度,对照标准曲线求出蛋白质含量,计算其浓度.（表示为mgPr/g材料） 4比活力、得率及纯化倍数计算：SOD的比活力为=总活力（units）/总蛋白量（mg）SOD总得率为：总得率=最后样品活率/样1活率*100%纯化倍数=比活2/比活1三、结果与讨论：<一> SOD活性及蛋白质测定结果：1蛋白质含量测定：表1. 牛血清制作蛋白质标准曲线（蛋白质含量/ ug）蛋白质含量/ug010203040506070OD值00.1740.2690.3420.4290.5480.6900.767

13、图1. 牛血清制作蛋白质标准曲线（蛋白质含量/ ug）<二 >硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩过程表2. 连苯三酚自氧化速率(A325)连苯三酚/ulA样100.070样120.071样150.075样100.073表3. 连苯三酚测样品SOD活性(A325)连苯三酚/ul酶/ulA样101000.031样12800.036样151100.039样10400.038表4. 考马斯蓝G-250测样品蛋白含量(A595)：样品体积/ulOD平均值（nm）样300.347样500.681样600.839样50 0.868 根据蛋白质标准曲线求出蛋白质含量：样 29.651ug样 61.16

14、0 ug样 76.066 ug样 78.802ug<三 >葡聚糖凝胶层析分离纯化SOD实验结果表4. 葡聚糖G100凝胶层析洗脱曲线（以A280吸收作为蛋白质含量的相对值）试管号（1）（2）（3）（4）（5）吸光值(nm)0.0791.1450.5910.1840.082试管号(6)(7)(8)(9)(10)吸光值(nm)0.0550.0490.0490.0480.048图2. 葡聚糖Sephadex G100凝胶层析分蛋白质洗脱曲线经连苯三酚粗测，（3）号管颜色最浅，而根据蛋白质洗脱曲线看出（3）号管位于蛋白质含量峰上，所以选取（3）号管作为目的试管收集SOD，测量其准确SOD活

15、力和蛋白含量，计算SOD比活力。连苯三酚自氧化速率:连苯三酚=12ul; A=0.075表6. 连苯三酚测样品SOD活性(A325)试管号连苯三酚/ul样品/ulA101500.038 101500.042101500.045101500.042101500.046101500.051 101500.041101500.045101500.049101500.050考马斯蓝G-250测样品蛋白含量: 样品体积=50ul OD平均值=0.366nm则根据蛋白质标准曲线求出蛋白质含量=31.443ug计算得：1.比活力的计算加入酶量相当的酶活力单位(unit)=（A-A）/A*2样 (0.070-

16、0.031)/0.07*2=1.11样 (0.071-0.036)/0.071*2=0.99样 (0.075-0.039)/0.075*2=0.96样 (0.073-0.038)/0.073*2=0.96试管（3） (0.075-0.038)/0.075*2=0.99提取液的总活力(unit)=加入酶量相当的酶活力单位*（反应液总体积/取样液体积）*稀释倍数样 1.11*（200/0.100）=2220样 0.99*（170/0.080）=2103.75样 0.96*（150/0.110）=1309.1样 0.96*（50/0.040）=1200试管（3） 0.99*（20/0.100）=19

17、8总蛋白量（mg）=（反应液总体积/取样液体积）*取样液蛋白含量样 （200/0.030）*0.029651=197.67样 （170/0.050）*0.061160=207.94样 （150/0.060）*0.076066=190.165样 （50/0.050）*0.078802=78.802试管（3） （20/0.050）*0.031443=12.58SOD的比活力为=总活力（units）/总蛋白量（mg）样 2220/197.67=11.23样 2103.75/207.94=10.12样 1309.1/190.165=6.88样 1200/78.802=15.23试管（3）198/12.

18、58=15.732.得率的计算得率=本次总活力/上次总活力*100%（1）2103.75/2220*100%=94.76%（2）1309.1/2103.75*100%=62.23%（3）1200/1309.1*100%=91.67%（4）198/1200*100%=16.5%SOD总得率=最后样品活力/样1活力*100% =198/2220*100% =8.92%3.纯化倍数的计算纯化倍数=比活2/比活1（1） 10.12/11.23=0.90（2） 6.88/10.12=0.67（3） 15.23/6.88=2.21（4） 15.73/15.23=1.03图3.各纯化步骤中SOD总酶活变化趋

19、势 图4.各纯化步骤中SOD总蛋白含量变化趋势图5. 各纯化步骤中SOD比活变化趋势1.可以看出，在25g绿豆中随着不断的分离提纯，总活力不断减小，比活力先下降后上升，最后总纯化倍数为1.03，活性得率为8.92%，达到预期效果。2. 为什么要从植物中提取SOD？初步验证阶段。国外SOD主要应用于医疗、保健方面，有以动物血液及内脏为原料制取SOD的报导，但存在着成本高、含有致热因子等缺陷，因此，适用范围极为有限。尤其是近年来受“疯牛病”的影响，许多国家和地区抵制以动物血液及内脏为原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在国际市场上极为紧缺。从植物，特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD，使用安全性非常高，避免了可能发生的交叉感染。利用全新的生物技术从植物中提取SOD，具有明显的社会和经济效益，市场前景广