悬浮培养法分离人前列腺癌PC―3细胞系类干细胞实验探究

1、悬浮培养法分离人前列腺癌pc-3细胞系类干细胞实验探究摘要：目的从人前列腺癌pc-3细胞系中分离鉴定 前列腺癌干细胞。方法分别用含血清及无血清培养基培养 前列腺癌细胞系pc-3细胞，采用流式细胞术检测细胞中前 列腺癌类干细胞的比例。结果pc-3细胞可以在无血清培养 液中生存并形成可以稳定传代的悬浮细胞球，细胞中cd44+、 cd133+及sp细胞比例均显著高于pc-3贴壁细胞的比例。结 论 通过无血清悬浮聚球培养可以从pc-3细胞中简便、高效 地分离出前列腺癌类干细胞。关键词：前列腺癌；悬浮培养法；干细胞前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，通过手术切 除、放疗和内分泌治疗等。传统治疗手段虽然可

2、以获得较好 的早期疗效，但并不能完全阻止前列腺癌的进展和复发。肿 瘤干细胞(tumor stem cells, tsc)被认为是肿瘤发生、 发展、转移和复发的根源1。已有学者分别从乳腺癌和脑 肿瘤等实体瘤中成功分离出相应的tsco本文采用添加了生 长因子的无血清培养基培养前列腺癌类干细胞，再通过流式 细胞仪检测其中具有干细胞特性的阳性细胞比例，并进一步 鉴定其增殖等特性，从而为进一步深入研究人前列腺癌干细 胞(human prostate cancer stem cell, hpcsc)奠定基础，为前列腺癌的临床诊治提供新的思路。1资料与方法1.1 一般资料 人前列腺癌pc-3细胞购自中国科学

3、院昆 明细胞库。含血清培养基 （serum-supple-merited medium, ssm）为含10%特级胎牛血清（中国bd公司）的dmem/f12c1b1,美国invitrogen/gibc公司）培养基，并添加2 mmol/l l- medium, sfm）为不含胎牛血清的dmem/f12 （1b1）培养基,谷氨酰胺（美国sigma公司）;无血清培养基 （serum-free并添加2 mmol/l l-谷氨酰胺、人表皮生长因子（human epidermal growth factor, egf）、人碱性成纤维生长因子（human basic fibroblast growth fac

4、tor, bfgf） 等。 流 式细胞仪（美国becton dickinson公司）、全自动荧光酶标 仪（美国thermo公司）等均由中科院昆明动物研究所提供。1. 2方法1.2. 1前列腺癌pc-3细胞的培养将pc-3细胞接种于 50 ml玻璃培养瓶，添加ssm,在37°c. 5%c02饱和湿度培 养箱中培养。1.2.2前列腺癌类干细胞球的培养分化 将处于对数生 长期的贴壁细胞进行消化、重悬于sfm中，每个培养皿悬浮 培养1x104个细胞，每天间断摇动培养皿，以阻止细胞贴 壁，半量换取培养皿中的培养液，更换1次/23 do待培 养皿中细胞增殖、形成悬浮细胞球后进行收集，吹打成单细

5、胞悬液并按1 ： 2传代。分别于细胞接种后5 d、10 d、15 d 统计直径超过60 um的悬浮细胞球数目，选取5个连续视野, 用平均法计算pc-3悬浮细胞球的形成率。每23d向形成 悬浮细胞球的sfm中滴加fbs,在ssm和sfm中交替培养pc-3 成球细胞，观察并记录pc-3成球细胞的生长方式。1. 2. 3流式细胞学分选cd44+、cd133+及sp细胞 以pc-3 悬浮成球细胞为实验组，以pc-3单层贴壁细胞为对照组。 将两种细胞重悬为单细胞悬液，进行染色。应用荧光激活细 胞分选法和紫外光激发后双波长分析法检测cd44+、cd133+ 及sp细胞比例。染色严格依照厂商说明书上标示的操作流 程。1.3统计学分析采用spss17. 0软件包进行统计学分析。 计量资料用均数加减标准差(x±s)表示，计数资料用频数(n)或率()表示，p0. 05)o在sfm中滴加fbs后细胞球 变小，底部边缘细胞从细胞球中贴壁快速生长，7 d后基本 上看不到细胞球，完全显示为贴壁生长的单细胞。2. 3 pc-3悬浮成球细胞中cd44+、cd133+