2022年纤维素酶活力的测定

1、纤维素酶活力的测定1. 纤维素酶活力单位定义在 37,ph 值为 5.5 的条件下 , 每分钟从浓度为4mg/ml 的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u. 2. 测定原理纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖. 具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与dns试剂发生显色反应. 反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比 , 而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比. 因此 , 通过分光比色测定反应液颜色的强度 , 可以计算反应液中纤维素酶的活力. 3. 试剂与溶液除特殊说明外 , 所用的试剂均为分析纯, 水均为符合gb/t6

2、682 中规定的三级水. 3.1 葡糖糖溶液 ,c(c6h12o6) 为 10.0mg/ml: 称取无水葡萄糖1.000g, 加水溶解 , 定容至 100ml. 3.2 乙酸溶液 ,c(ch3cooh)为 0.1mol/l: 吸取冰乙酸0.60ml. 加水溶解 ,定容至 100ml. 3.3 乙酸钠溶液 ,c(ch3coona) 为 0.1mol/l: 称取三水乙酸钠1.36g. 加水溶解 , 定容至 100ml. 3.4 氢氧化钠溶液,c(naoh) 为 200g/l: 称取氢氧化钠20.0g. 加水溶解 , 定容至 100ml. 3.5 乙酸乙酸钠缓冲溶液,c(ch3cooh ch3coo

3、na)为 0.1mol/l,ph值为 5.5: 称取三水乙酸钠23.14g, 加入冰乙酸1.70ml. 再加水溶解 , 定容至 2000ml. 测定溶液的ph值.如果 ph值偏离 5.5, 再用乙酸溶液(3.2) 或乙酸钠溶液(3.3) 调节至 5.5. 3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v) 称取羧甲基纤维素钠(sigma c5678)0.80g, 加入 80ml 乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌 ,同时缓慢加热 , 直至羧甲基纤维素钠完全溶解( 注: 在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液, 但是溶液的总体积不能超过100ml.).然后停止加热 , 继续搅拌30min, 用乙

4、酸乙酸钠缓冲溶液 (3.5) 定容至100ml. 羧甲基纤维素钠溶液能立即使用, 使用前适当摇匀.4 避光保存 ,有效期为3 天. 3.7 dns 试剂称取3,5- 二硝基水杨酸3.15g( 化学纯 ), 加水500ml, 搅拌5s, 水浴至45. 然后逐步加入100ml 氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌, 直到溶液清澈透明(注意 : 在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48.).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g, 苯酚 2.50g 和无水亚硫酸钠2.50g. 继续45水浴加热 , 同时补加水300ml, 不断搅拌 , 直到加入的物质完全溶解. 停止加热, 冷却至室温后, 用水定容至1

5、000ml. 用烧结玻璃过滤器过滤. 取滤液 , 储存在棕色瓶中, 避光保存 . 室温下存放7 天后可以使用, 有效期为6个月 . 4 仪器与设备4.1 实验室用样品粉碎机或碾钵. 4.2 分样筛 : 孔径为 0.25mm(60 目). 4.3 分析天平 : 感量 0.001g. 4.4 ph 计: 精确至 0.01. 4.5 磁力搅拌器 : 附加热功能 . 4.6 电磁振荡器 . 4.7 烧结玻璃过滤器: 孔径为 0.45m. 精品学习资料 可选择p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - -精品学习资料 可选择

6、p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - -4.8 离心机 :2000g 以上 . 4.9 恒温水浴锅 : 温度控制范围在3060之间 , 精度为 0.1 . 4.10 秒表 : 每小时误差不超过5s. 4.11 分光光度计 : 能检测 350800nm的吸光度范围. 4.12 移掖器 ; 精度为 1l. 5 标准曲线的绘制吸取缓冲液 (3.5)4.0ml,加入 dns试剂 (3.7)5.0ml,沸水浴加热5min. 用自来水冷却至室温,用水定容至25.0ml, 制成标准空白样. 分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.

7、00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00和 7.00ml, 分别用缓冲液 (3.5)定容至 100ml, 配制成浓度为0.10 0.70mg/ml 葡萄糖标准溶液. 分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml( 做二个平行 ), 分别加入到刻度试管中,再分别加入2ml 水和 5mldns试剂 (3.7).电磁振荡 3s, 沸水浴加热5min. 然后用自来水冷却到室温 , 再用水定容至25ml. 以标准空白样为对照调零, 在 540nm处测定吸光度od值. 以葡萄糖浓度为y轴 ,吸光度 od值为 x轴 , 绘制标准曲线 . 每次新配制dns试剂均需要重新绘制标准曲线 . 6

8、 试样溶液的制备固体试样应粉碎或充分碾碎, 然后过 60 目筛 ( 孔径为 0.25mm). 称取试样两份 , 精确至 0.001g. 加入 50ml 乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5).磁力搅拌 30min, 再用缓冲溶液 (3.5) 定容至100ml, 在 4条件下避光保存24h. 摇匀 , 取出 30-50ml,2000g离心3min. 吸取 5.00ml 上清液 , 再用缓冲溶液 (3.5) 做二次稀释 ( 稀释后的待测酶液中纤维素酶活力最好能控制在0.04 0.08 u/ml之间 ). 液体试样可以直接用乙酸乙酸钠缓冲溶液(3.5)进行稀释 , 定容 (稀释后的酶液中纤维素酶活力最好能控制

9、在0.04 0.08 u/ml 之间 ). 如果稀释后酶液的ph值偏离 5.5, 需要用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液 (3.3)调节 , 校正至 5.5, 然后再用缓冲溶液(3.5) 做适当定容 . 7 测定步骤吸取 10.0ml 羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37平衡 10min. 吸取 10.0ml 经过适当稀释的酶液,37 平衡 10min. 吸取 2.00ml 经过适当稀释的酶液( 已经过 37平衡 ), 加入到刻度试管中, 再加入 5mldns试剂(3.7),电磁振荡 3s. 然后加入 2.0ml 羧甲基纤维素钠溶液(3.6),37保温 30min, 沸水浴加热 5min. 用自来

10、水冷却至室温, 加水定容至25ml, 电磁振荡3s. 以标准空白样为空白对照, 在540nm处测定吸光度ab. 吸取 2.0ml 经过适当稀释的酶液( 已经过 37平衡 ), 加入到刻度试管中, 再加入 2.0ml 羧甲基纤维素钠 (3.6)(已经过 37平衡 ), 电磁振荡 3s,37 精确保温30min. 加入 5.0mldns试剂(3.7),电磁振荡3s, 酶解反应 . 沸水浴加热5min, 用自来水冷却至室温,加水定容至25ml, 电磁振荡 3s. 以标准空白样为空白对照, 在 540nm处测定吸光度ae. 8. 试样酶活力的计算(ae - ab)k + coxd = 1000 (1)

11、m t式(1) 中: xd 试样稀释液中的纤维素酶活力,u/ml; ae 酶反应液的吸光度; ab 酶空白样的吸光度; k 标准曲线的斜率; 精品学习资料 可选择p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - -精品学习资料 可选择p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - -co 标准曲线的截距; m 葡萄糖的分子量(180.2); t 酶解反应时间,min; 1000 转化因子 ,1mmol = 1000 umol. xd值应在 0.0

12、4 0.08 u/ml 之间 . 如果不在这个范围内, 应重新选择酶液的稀释度, 再进行分析测定 . x = xd ?df (2) 式(2) 中: x 试样纤维素酶的活力,u/g; df 试样的总稀释倍数. 酶活力的计算值保留三位有效数字. 9 重复性同一样品两个平行测定值的相对误差不超过8.0%, 二者的平均值为最终的酶活力测定值( 保留三位有效数字) 精品学习资料 可选择p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - -精品学习资料 可选择p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 3

13、页，共 5 页 - - - - - - - - -1. 药品、试剂及仪器脂肪酶 (novezymes 公司 ) ，0.0667 mol/l 的 kh2po4-na2hpo4 缓冲溶液 (ph 值为 7.38 ； ) ，脂肪酸显色剂 (5%醋酸铜溶液，用吡啶调节ph=6.2) ，正己烷，油酸，橄榄油，盐酸，无水乙醇，分光光度计，ph计，水 / 油浴恒温磁力搅拌器，离心机，分析天平等。2. 脂肪酸吸光度工作曲线的绘制配制一系列不同浓度（1.5 ，2.5 ，3.5 ，4.5 ，5.5 ，6.5 ，7.5 ，10，12.5 ，15mol/ml）的油酸正己烷溶液，分别取5 ml于 10 ml离心管中中，

14、加入1 ml显色剂，磁力搅拌3min， 油酸分子与cu2+生成绿色的络合物，离心后取上层有机相在714 nm处测定吸光度。用未加油酸的空白溶液作参比，以吸光度对油酸浓度作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线。3.酶液的配置分别称取固定化酶0.1 g 左右溶于2ml ，ph=7.4，0.0667 mol/l 的磷酸缓冲溶液中，振荡均匀， 40水浴预热待用。4. 酶活测定方法实验组：取3 ml.0.0667 mol/l 磷酸盐缓冲溶液和1ml橄榄油，放入超声仪恒温50超声 10min， 加入 2 ml （含 0.1 g 酶制剂）酶溶液（先超声混匀10min） ，磁力搅拌15 min，立即加入1m

15、l6 mol/l 盐酸溶液和6 ml的 95% 无水乙醇溶液， 振荡 2 min，终止反应。分别加入 6 ml正己烷溶液萃取生成的脂肪酸。取上层有机相5 ml于 10 ml离心管中，加入1ml显色剂，涡旋均匀后，产生的脂肪酸与cu2+ 生成绿色络合物。静置离心10 min 后, 取上层含有脂肪酸铜的正己烷溶液，在714 nm波长处测其吸光度。空白组：以相同方法制备不含脂肪酶的空白溶液为参比，对照脂肪酸吸光度工作曲线，即可求得脂肪酸的浓度。5. 酶活定义及计算公式脂肪酶酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1mol 脂肪酸的酶量定义为1 个脂肪酶活力单位(u) 。按下式计算酶活：x=cv/tm式中： x 为脂肪酶活力，u/g， c 为脂肪酸浓度，mol/ml；v 为脂肪酸溶液的体积，ml ；m为酶液的用量，g；t 为作用时间，min。精品学习资料 可选择p d f - - - - - - - - - - - - - - 第 4 页，共 5 页 - - - - - - - - -精品