第五讲分子标记技术与环境微生物多样性分析1

1、第五讲第五讲 分子标记技术与环境微分子标记技术与环境微生物多样性分析生物多样性分析 广义的分子标记是指可遗传的并可检测的广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNADNA或或蛋白质。蛋白质。 狭义的分子标记概念只是指狭义的分子标记概念只是指DNADNA标记，这种界定标记，这种界定目前已经被广泛采纳。目前已经被广泛采纳。 蛋白质标记包括种子储藏蛋白和同工酶及等位酶。蛋白质标记包括种子储藏蛋白和同工酶及等位酶。 利用现代分子生物学技术揭示利用现代分子生物学技术揭示DNADNA序列的变异，就序列的变异，就可以建立可以建立DNADNA水平上的遗传标记。水平上的遗传标记。一、限制性片段长度多态性分析一、限

2、制性片段长度多态性分析（一）（一）RFLP分析的基本原理分析的基本原理 （Restriction fragment length polymorphism） 碱基的改变染色体结构的变化导致生物个体或种碱基的改变染色体结构的变化导致生物个体或种群之间群之间DNA片段酶切位点的变化，用限制性内切酶片段酶切位点的变化，用限制性内切酶切割改变的切割改变的DNA则产生长短、种类、数目不同的限则产生长短、种类、数目不同的限制性片段，通过对不同限制性片段的电泳分析，从而制性片段，通过对不同限制性片段的电泳分析，从而获得微生物种群遗传变异的有关信息。获得微生物种群遗传变异的有关信息。限制性内切酶：专一的识别序

3、列内（通常为限制性内切酶：专一的识别序列内（通常为46bp）的恒定位置碱基并在此位置切割的恒定位置碱基并在此位置切割DNA的酶。的酶。 如如BamH G GATC C C CTAG G Pst C TGCA G G ACGT CCATATG GATCCATCGAGCTTGTATACCTAG GTAGCTCGAA（二）限制性片段的长度分布图像（二）限制性片段的长度分布图像 分离提取分离提取DNA通过通过PCR扩增目的扩增目的DNA片片段段限制性内切酶酶解限制性内切酶酶解琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察拍照。紫外灯下观察拍照。BamH I 酶切Hind酶切EcoR酶切123 1 2 3 M

4、（三）（三）限制性酶切产物与探针杂交的放射自显影限制性酶切产物与探针杂交的放射自显影限制性内切酶酶解限制性内切酶酶解琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳转膜印转膜印迹迹探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影观察拍照观察拍照BamH I 酶切Hind酶切EcoR酶切123 1 2 3 M* * *（四）（四）RFLP的应用范围的应用范围 为微生物群落水平的变异提供有用的遗传标记，为微生物群落水平的变异提供有用的遗传标记，属内种间的变异和科内属间的变异的研究成果表明属内种间的变异和科内属间的变异的研究成果表明RFLP的明显差异性。的明显差异性。 采用多个基因片段进行采用多个基因片段进行RFLP分析对于高层次

5、分析对于高层次分类群的系统学研究是可行的。分类群的系统学研究是可行的。二、随机扩增多态性二、随机扩增多态性DNA技术技术(Random amplified polymorphism DNA, RAPD)（一）基本原理（一）基本原理 以非限制性的随机寡核苷酸链为引物，通常以非限制性的随机寡核苷酸链为引物，通常10个随机排列的寡核苷酸构成个随机排列的寡核苷酸构成1条随机引物链。由条随机引物链。由于目的基因组序列于目的基因组序列DNA通常都是很长的大分子通常都是很长的大分子DNA，寡核苷酸引物有足够的机会与模板寡核苷酸引物有足够的机会与模板DNA同同源碱基配对结合，延伸源碱基配对结合，延伸 扩增扩增

6、2个紧邻结合点间的个紧邻结合点间的DNA片段，扩增的片段与目的基因组有同源序列。片段，扩增的片段与目的基因组有同源序列。扩增后有扩增后有4种结果：种结果：1、没有扩增带出现；说明引物链与目的基因组、没有扩增带出现；说明引物链与目的基因组DNA没有同源区；没有同源区；2、不同测试标本中，都产生相同大小的、不同测试标本中，都产生相同大小的DNA扩增谱扩增谱带；说明这些测试样本为同一物种。带；说明这些测试样本为同一物种。3、不同测试样本，产生相同或不相同的谱带。说明、不同测试样本，产生相同或不相同的谱带。说明测试样本间具有同源性，可依据公式计算其相关性。测试样本间具有同源性，可依据公式计算其相关性。

7、4、不同测试标本，产生的带形完全不同。、不同测试标本，产生的带形完全不同。 可用于鉴可用于鉴别不同的物种。这些扩增后的别不同的物种。这些扩增后的DNA谱带称为随机扩谱带称为随机扩增多态性增多态性DNA（RAPD）。）。（二）（二）RAPD的操作程序的操作程序1、模板、模板DNA的制备的制备 RAPD只需少量的只需少量的DNA模板，对模板，对DNA提取的质量提取的质量要求也不高。模板量从要求也不高。模板量从10ng25ng均可观察到多态性。均可观察到多态性。2、随机引物的选择、随机引物的选择 随机引物系列已商品化，研究物种不同（如微生随机引物系列已商品化，研究物种不同（如微生物、动植物），对引物

8、并无要求。物、动植物），对引物并无要求。3、DNA扩增反应扩增反应 DNA聚合酶的用量聚合酶的用量 反应体积为反应体积为25l时，时，0.8U的的Taq酶较合适。太多酶较合适。太多 易产生非特异性条带，太少影响反应产量。易产生非特异性条带，太少影响反应产量。 退火温度的选择退火温度的选择 一般采用较低的退火温度或降落一般采用较低的退火温度或降落PCR退火温度。退火温度。 脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 一般用约一般用约0.6mol/L的浓度。的浓度。 扩增循环数扩增循环数 循环数影响循环数影响PCR最终产量，常采用两步法。最先最终产量，常采用两步法。最先5个循环后，条件不变再循环个循环后，条件不变再

9、循环2030个。个。（三）（三）RAPD在微生物分类鉴定中的应用在微生物分类鉴定中的应用 常采用培养特性、表型特征、生理生化特点等传统常采用培养特性、表型特征、生理生化特点等传统分类鉴别方法来对细菌进行分类，但这些传统方法不分类鉴别方法来对细菌进行分类，但这些传统方法不能完全准确、可靠地鉴别不同的型或亚型。能完全准确、可靠地鉴别不同的型或亚型。 有实验用随机引物扩增鉴别了有实验用随机引物扩增鉴别了20种不同血清型沙门种不同血清型沙门氏菌，证明氏菌，证明RAPD对沙门氏菌基因分型完全适用。对沙门氏菌基因分型完全适用。 RAPD与限制性内切酶分析法同时鉴别比较与限制性内切酶分析法同时鉴别比较2株金

10、株金黄色葡萄球菌，两者所得结果完全一致，可区别出每黄色葡萄球菌，两者所得结果完全一致，可区别出每个分离株。个分离株。三、三、DNA单链构象多态性技术单链构象多态性技术（Single strand conformation polymorphism, SSCP）（一）基本原理一）基本原理 单链单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时，会或多或少来维持的。当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。空间构象有地影响其空

11、间构象，使构象发生改变。空间构象有差异的单链差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。 （二）操作程序二）操作程序1、PCR产物的准备产物的准备 进行进行PCR时，设计的引物特异性要强，这样才能保证扩时，设计的引物特异性要强，这样才能保证扩增出特异的产物。增出特异的产物。 2、PCR产物单链凝胶电泳产物单链凝胶电泳电泳装置电泳装置凝胶配制凝胶配制上样缓冲液及变性剂上样缓冲液及变性剂 有用甲酰

12、胺的，也有用有用甲酰胺的，也有用FicollFicoll的，也有用氢氧化甲基的，也有用氢氧化甲基汞的。汞的。电泳温度电泳温度 可室温，也可加温；可恒温，也可变温。可室温，也可加温；可恒温，也可变温。（三）三）PCR-SSCP的优缺点的优缺点优点：优点： 操作简单，技术容易掌握，操作简单，技术容易掌握，PCR产物变性后无需处产物变性后无需处 理可直接电泳。理可直接电泳。 实验步骤少，周期短，最快可在实验步骤少，周期短，最快可在4小时内完成。小时内完成。 成本低，所用试剂均价廉。成本低，所用试剂均价廉。缺点：缺点： 不能确定变异的位置；不能确定变异的位置； 检测存在假阴性；检测存在假阴性； 对于大

13、于对于大于300bp的的DNA片段，随着长度增加，检测片段，随着长度增加，检测的灵敏性逐渐降低。的灵敏性逐渐降低。四、扩增性限制性酶切片段分析及其应用四、扩增性限制性酶切片段分析及其应用（Amplified ribosomal dNA restriction analysis,ARDRA) （一）一）ARDRA的基本原理的基本原理 ARDRA是基于是基于PCR选择性扩增选择性扩增rDNA片段，再对片段，再对rDNA片段进行限制性酶切片段长度多态性分析。片段进行限制性酶切片段长度多态性分析。 主要操作步骤：主要操作步骤： 提取总提取总DNA； 以总以总DNA为模板，扩增为模板，扩增rDNA基因的

14、保守序列；基因的保守序列； 选择多种有四对碱基识别位点的内切酶进行酶切；选择多种有四对碱基识别位点的内切酶进行酶切； 琼脂糖凝胶电泳；琼脂糖凝胶电泳； 对对ARDRA诊断谱带进行系统分析及计算机聚类。诊断谱带进行系统分析及计算机聚类。 （二）二）ARDRA的操作程序的操作程序1、样品中总、样品中总DNA的分离的分离 可用直接法和间接法。可用直接法和间接法。2、选取专一引物进行、选取专一引物进行PCR扩增扩增rDNA片段片段 原核生物原核生物16S rDNA含含1500bp，可以进行有关系可以进行有关系统发育的研究。统发育的研究。3、限制性酶切扩增产物、限制性酶切扩增产物 选择选择25个合适的限

15、制内切酶对个合适的限制内切酶对16S rDNA扩增产扩增产物进行联合酶切。物进行联合酶切。4、琼脂糖凝胶电泳分离、琼脂糖凝胶电泳分离5、对、对ARDRA谱带进行分析谱带进行分析 根据谱带结果计算出样品（菌株）间的根据谱带结果计算出样品（菌株）间的DNA片段片段同源性（同源性（F），），计算方法为：计算方法为： F = 2 NXY /（NX + NY） NXY表示这表示这2个样品共有的片段数目。个样品共有的片段数目。 NX表示表示X样品有而样品有而Y样品没有的片段数。样品没有的片段数。 NY表示表示Y样品有而样品有而X样品没有的片段数。样品没有的片段数。 然后再根据然后再根据F值进行计算机聚类分

16、析。值进行计算机聚类分析。 如果得到的电泳图谱中条带较多，可以应用计算如果得到的电泳图谱中条带较多，可以应用计算机软件对所获得的遗传距离矩阵进行聚类分析，得出机软件对所获得的遗传距离矩阵进行聚类分析，得出反映菌株间系统发育关系的聚类分析树状图谱。反映菌株间系统发育关系的聚类分析树状图谱。（三）三）ARDRA技术的应用技术的应用1 1、从环境中发现新种属微生物、从环境中发现新种属微生物 1997年有人应用年有人应用ARDRA技术并结合化学、生技术并结合化学、生理学方法，在获得理学方法，在获得25株能降解烯丙吗啡的微生物株能降解烯丙吗啡的微生物中发现了一个新种。中发现了一个新种。2、微生物的分类与

17、鉴定、微生物的分类与鉴定 1994年，有人用年，有人用ARDRA技术对技术对48株根瘤菌株株根瘤菌株进行分析，并将结果与其他分类学方法进行了比进行分析，并将结果与其他分类学方法进行了比较，发现较，发现ARDRA法所得到的基因型与法所得到的基因型与16S rRNA测序测序所得结果一致。所得结果一致。五、扩增的限制性片段长度多态性技术五、扩增的限制性片段长度多态性技术 (Amplified fragment length polymorphism)（一）基本原理一）基本原理 基因组基因组DNA经限制性内切酶完全消化后，在限经限制性内切酶完全消化后，在限制性片段两端连接上人工接头作为扩增的模板。设制

18、性片段两端连接上人工接头作为扩增的模板。设计的引物与接头和酶切位点互补，并在计的引物与接头和酶切位点互补，并在3端加上端加上23个碱基，因此在基因组被酶切后的无数片段中，个碱基，因此在基因组被酶切后的无数片段中，只有一小部分限制性片段被扩增。只有一小部分限制性片段被扩增。GAATTCCTTAAGTTAAAATT5335AATTC GTAATTTAA55TAAATTCTTAAGTTAAAATTEcoR 和Mse酶切EcoR接头Mse接头5 EcoR引物 + AC + Mse引物5AATTCATTAAGTGTTAACAATT5EcoR引物 + AACCAT +Mse引物5AATTCAACTTAAG

19、TTGTTGTTAAAACAATT变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与检测变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与检测（二）操作程序二）操作程序1、限制性消化与接头连接、限制性消化与接头连接 酶切后基因组酶切后基因组DNA产生产生EcoR- EcoR片段，片段，Mse- Mse片段片段和和EcoR-Mse片段。由于引物设计和扩增策略的巧妙使用使得片段。由于引物设计和扩增策略的巧妙使用使得EcoR-Mse片段的扩增占优势。片段的扩增占优势。 扩增产物小于扩增产物小于1kb，适于在聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离。适于在聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离。2、PCR扩增扩增 分两步，第一步预扩增，用连好接头的限制性片段作模板，分两步，第一步预扩增，用连好接头的限制性片段作模板，用各有一个选择碱基的引物对进行预扩增。用各有一个选择碱基的引物对进行预扩增。 第二步，预扩增的产物经稀释第二步，预扩增的产物经稀释20倍后作为选择性扩增的模板。倍后作为选择性扩增的模板。3、扩增产物的分离与检测、扩增产物的分离与检测 在在5%或或6%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离。变性