月见草油抑制巨噬细胞炎症因子的作用研究VIP

1、月见草油抑制巨噬细胞炎症因子的作用研究1宁夏医科大学回医药现代化省部共建教育部重点实验室；2宁夏医科大学总医 院口腔医院；3宁夏医科大学牛育力保持建教育部重点实验室宁夏银川750004【摘 要】探讨月见草油对巨噬细胞释放的炎症因子的抑制作用。结果显示月见 草油对小鼠巨噬细胞的形态有显著性的改变，抑制脂多糖诱导后释放的炎症因子, rt-pcr结果表明月见草油显著性抑制了环氧合酶2的表达(pv0.05),降低了 pge2的表达水平；elisa结果表明月见草油显著性地抑制和剂量依赖性地减少了 一氧化氮合酶(inos)和肿瘤坏死因子(tnf-a)减少，白介素-lβ(il-l&

2、beta;) 的产生(p<0.05)o结果表明月见草油在炎症反应中扮演了保护作用，月见草油 是一种功能性治疗药物。刖b月见草油是从月见草(晚樱草)种子中提炼出来的油脂，其含有丰富的 多聚不饱和必需脂肪酸，主要成分为&gamma;-次亚麻油酸，己经报道其中 &omega;-6系列必须脂肪酸具有多项治疗作用，对心血管疾病，经前症候群，更 年期综合征和糖尿病神经病变等具有疗效(l)o研究报道一氧一氧化氮在炎症反 应和免疫反应中扮演重要的作用，巨噬细胞又是常见的一氧化氮合成的主要细胞 来源，因此通过脂多糖诱导巨噬细胞inos合成，而r巨噬细胞能够产牛tnf-a, il-l&

3、;beta;因子，巨噬细胞激活也可以产牛环氧合酶，和前列腺e2 (pge2),这 些因子在炎症反应的病理过程中具有重要的作用(2),木研究鉴于月见草对巨噬 细胞产牛的炎症反应报道较少，利用提取的月见草油研究对tnf-a, il-l&beta; 因子和环氧合酶的影响，1材料和方法1.1材料和试剂月见草油购自美国公司，含量为，按照比例贮存液溶解在dmso中，工 作液溶解在细胞培养液中.trizonl试剂和rpmi1640培养基购自life-tech公司，鼠 inos合酶，鼠il-l&beta;,鼠tnf-a因子elisa试剂盒均购自博士德生物公司， western试剂购自cox-2

4、抗体和pge2抗体购自博奥森生物公司。1.2巨噬细胞培养及处理按照实验室常规方法，解冻巨噬细胞raw264.7,用rpmi1640基础培 养基补充10%胎牛血清(f&beta;s), 100iu请链霉素,以1x106个/ml密度接种， 在培养箱24孔板中生长过夜，次日换新鲜培养基(5%f&beta;s)含有浓度为 5ug/ml的lps,同吋添加不同浓度月见草油，实验分为高浓度组(200ug/ml), 中浓度组(100ug/ml),低浓度组(50ug/ml)和空白对照组。1.3细胞增殖活力wst法检测按照文献(4)常规试验方法用wst的方法评价月见草油对lps诱导的 炎症反应的效

5、果。1.4 elisa法测量一氧化氮tnf-a减少，白介l-l&beta;的产生按照文献(2)常规方法分别取looul的处理后的细胞培养上清液，按 照elisa试剂盒的操作规程检测inos, tnf-a和il-l&beta;的吸光度值，利用说明 书中标准溶液制备标准曲线，计算出各个处理对应的浓度。1.5 rt-pcr 检测 pge2 和 cox-2 mrna 表达按照文献(5)常规方法对各组处理的raw264.7细胞经过trizonl试剂 提取总rna,经过逆转录和pcr反应，pcr特异性引物分别是：pge2基因的上 游引物 5&prime;-ttgacctcagcgc

6、tgagttg-3&prime;,下游引物5&prime;-cctgtagcccacgtcgtagc-3&prime;； cox-2 基因的上游引物5&prime;-cactacatcctgacccactt-3&prime;,下游引物5&prime;-atgctcctgcttgagtatgt-3 x ； &beta;-actin 基因的上游引物5&prime;-gtgggccgccctaggcaccag-3&prime;,下游引物5&prime;-ggaggaagaggatgcggcagt-3&prime;

7、°pcr 反应条件为 95°c7mi n,94°c 45s, 60-65°c30s, 72°clmin, 72°c10min, 4°cforever, 30 个循环。经 1.2%琼脂 糖凝胶电泳和e&beta;染色分析pge2和cox-2 mrna表达1.6统计方法实验数据以均数&plusmn;标准差(&plusmn;sd)表示。并应用spss17统计软件系统以t检验及单因素方差分析进行统计分析。检验标准采用p = 0.05。 2结果不同处理组月见草油对巨噬细胞生长情况的影响巨噬细胞raw264.7经

8、过lps单独诱导后细胞形态固缩，单个细胞变圆, 当使用月见草油进行保护时，细胞形态显著性改变，随月见草浓度的增加，细胞 形态逐渐趋于正常，表明月见草油对产生炎症反应有显著性保护作用。图2月见草油对pge2和cox-2 mrna表达的影响2.3不同处理组月见草油对炎症因子分泌的影响如图3所示，elisa检测结果显示巨噬细胞经过lps和各种浓度的月见 草油处理后炎症因子的分泌显著性变化，与对照组相比lps显著性诱导inos、 tnf-a 和 il-l&beta;的分泌(p<0.05)；高浓度组(200ug/ml),中浓度组(100ug/ml) 和低浓度组(50ug/ml)的月见草油处

9、理后inos、tnf-a和ill&beta;的分泌水平 显著性下降(p<0.05)o图3月见草油对inos、tnf-a和ill&beta;分泌水平的影响3讨论月见草原名晚樱草，被誉为生命之花；在欧洲被称之为“皇室御药”或 “国王药物蔦月见草油是从月见草种子中提取的天然产物，已报道产物主要成 分为&gamma;-次亚麻油酸，其中还含有丰富的镁，锌，铜、维生素c、e、&beta;6> &beta;5等微量元素和维生素，不同于常见的普通植物油、大豆油、葵花油中所 含的&omega;-6亚麻油酸，文献报道在抗炎，抗菌和降低胆固醇和抗癌治疗中有

10、 一定作用(1)。因此在体内扮演着许多重要的角色。服用后可以治疗心血管疾病， 经前症候群，更年期综合症等多种疾病。&gamma;-次亚麻油酸在体内会产生一 种前列腺素el (pge1), pge1又会产生pge2的生理作用，对炎症有明显的改善 作用(3)。本研究证实在lps诱导作用下，产生大量的tnf-a, il-l&beta;和inos 等因子，当用不同浓度月见草油处理后，这些炎症因子显著性降低。月见草油抑制炎症的作用机理至今不能确定，但是，一些重要的因子已 经在不同的研究中鲜有报道，本研究中检测月见草油对pge2和cox-2的表达， 结果证明月见草油显著性抑制其表达，究其原

11、因，月见草油可能抑制了 nfk&beta; 通路的活性(2)。鉴于月见草油的显著性抗炎作用，下一步研究将分离提纯月见 草油的活性成分，用于抗炎，抗癌等的治疗中 参考文献：刘学，邱香，王哲，曹光群脱脂月见草子中多酚的提取分离及其抗氧化活性 研究j食品工业科技,2014, 24： 299-303.2 .weon-jong yoon, young min ham, byoung-sam yoo, et.ah oenothera laciniata inhibits lipopolysaccharide induced production of nitric oxide, prostagla

12、ndin e2, and proi nflammatory cytoki nes in raw264.7 macrophages journal of bioscie nee and bioengineering.vol.107 no.4, 429 &ndash; 438, 2009.3 .s.montserrat-de la paz, m.d.garc&iacute;a-gim&eacute;nez,m.&aacute;ngelmart&iacute;n, et.ab long-chain fatty alcohols from evening primrose oil inhibit the inflammatory response in murine peritoneal macrophagesjjournal of ethnopharmacology 151 (2014) 131 &a