2022年药学分子生物学

1、.第一章 基因与基因组基因 gene： 是指合成有功能的蛋白质、多肽或rna所需的全部 dna 序列（除部分病毒rna），是基因组的一个功能单位；基因组（ genome）： 是指生物体一套完整的单倍体遗传信息的总和，包括全部基因和基因间的区域；基因组的主要功能是贮存和表达遗传信息，是物种及其个体之间区分和联系的最本质生物学特点；基因组学（ genomics ）： 是讨论生物基因组的结构、功能及表达调控的一门科学；调控序列（顺式作用元件）： 一个基因的调控区和其结构基因位于同一个dna分子的相邻部位，这种调剂方式称为顺式调剂，相应的dna序列成为顺式作用元件；（1） 启动子： rna聚合酶特异性

2、识别和结合的dna序列； （ 2）增强子：能强化转录起始的一段 dna序列；（ 3）缄默子（ 4）终止子；反式作用因子：通过识别或结合顺式作用元件上的核心序列从而参加调控基因转录的蛋白质；也称转录因子；原核生物基因组结构特点:1. 具有类核结构2. 以操纵子为功能单位 / 多顺反子 mrna3. 结构基因大多为单拷贝，编码序列一般不重叠4. 结构基因大多没有含子5. 非编码序列比例约为一半6. 含可移动 dna 序列操纵子（ operon ）操纵子是原核生物的一段dna序列， 由几个串联排列的功能相关的结构基因，加上调剂序列组成的一个完整的连续的功能单位；操纵子结构通常与启动子区域有部分重叠，

3、可通过代物与调剂蛋白相互作用而激活或抑制基因转录，这是原核生物最常见的转录调剂方式；真核生物基因组结构特点1. 基因组巨大，为线状双链dna2. 断裂基因3. 非编码区与单顺反子4. 大量重复序列5. 基因家族与假基因断裂基因（ split gene）: 真核生物结构基因由外显子与含子间隔排列，含子在转录后被剪切掉；基因家族（ multigene family）： 是来源相同，结构相像，功能相关的一组基因，由某一共同祖先基因经重复和突变产生；假基因（ pseudogene ）： 与具正常功能基因序列相像，但无转录功能或其转录产物无功能的基因；人类基因组方案（ hgp） hgp的主要目标 :.遗

4、传图谱：基因或dna标记在染色体的相对位置与遗传距离；.物理图谱：一级结构上两个dna片段之间的实际距离；.序列图谱：基因组dna的全部核苷酸序列；.转录图谱：正常或受控条件全基因表达的时空图；.hgp的意义 :.鉴定人类全部基因，推动生物技术进展；懂得疾病与基因的关系；推动模式生物讨论；促进多学科进展与交叉融合；不同生物基因组结构特点：病毒原核生物基因组较小，只含一种核酸 （ dna或 rna）真核生物基因组巨大， 为多条线状双链 dna（细胞核、细胞器dna）含有重叠基因具有类核结构、通常一条环状双链 dna分子（基因组、质粒 dna）以操纵子为功能单位（多顺反子 mrn）a结构基因大多为

5、单拷贝，编码序列一般不重叠断裂基因存在转录单元噬菌体基因连续，感染真核细胞的病毒基因不连续结构基因大多没有含子、连续的是非编码区远多于编码区单顺反子存在大量重复序列编码序列占绝大部分非编码序列比例约为一半基因家族与假基因主要为单拷贝序列（反转含可移动 dna 序列子）（转座dna末端具有端粒结构录病毒含有两个拷贝）蛋白质组（ proteome ）： 一个细胞、一个组织或者一个有机体的基因组表达的全部蛋白质；蛋白质组学（ proteomics）： 阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科；其次章 pcr、核酸杂交、基因芯片pcr基本原理： 以待扩增的 dna为模

6、板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在dna聚合酶作用下，以 dntp 为底物，依据半保留复制的原理，通过变性、退火、延长三个步骤完成新的 dna合成，并反复重复这一过程；pcr反应步骤：高温变性： 94 获单链模板低温退火： 55 引物结合单链模板适温延长： 72 dna 新链合成pcr反应体系： dna 模板、引物（打算pcr反应特异性） 、耐热 dna聚合酶、 dntp、缓冲体系 一、二价阳离子pcr与 dna复制的比较： 相同点：dna合成反应dna聚合酶参加需要引物4 种 dntp为原料不同点：体外反应仅合成特定 dna片段（由 1 对引物限定） 变温条件下进行.仅一种耐热

7、的dna聚合酶参加dna引物循环多次pcr反应体系的优化：特异性、有效性、忠实性1、dna聚合酶：耐高温、保真性、激活剂2、模板 dna：种类、用量、质量3、dntp: 浓度一样、稳固4、dna引物：打算 pcr扩增产物的特异性和长度；引物设计一般遵循的原就：长度； 碱基随机分布；防止引物间、 引物自身互补； 引物的 3 端不能修饰、不应错配；两条引物之间退火温度不大于5 oc；pcr技术的应用1) 基因克隆2) 基因检测(1) pcr 产物的限制性片段长度多态性分析（ pcr-rflp基因突变会导致基因序列中产生新的限制性核酸切酶位点或使原有限制性核酸切酶位点消逝；因此， 突变基因经相应的限

8、制性核酸切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生转变，依据这些转变可以判定突变是否存在，即限制性片段长度多态性技术；(2) pcr产物的单链构象多态性分析pcr-sscp基于单链 dna构象差别来检测点突变的方法；相同长度的单链dna由于碱基组成或排列次序不同，形成不同的构象；利用 pcr扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的转变会造成单链dna片段构象的转变，其迁移率随之转变，从而检测基因的突变；(3) pcr 产物的等位基因特异性寡核苷酸探针杂交pcr-aso采纳 pcr扩增受检者基因的目标片段，并与相应的aso探针杂交；针对已知突变位点的基因

9、，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针（n），与正常序列互补，另一个为突变型探针（m），突变碱基应位于探针的中心，与突变序列互补；pcr衍生技术（一）巢式 pcr（二）逆转录pcr rt-pcr先将 rna用反转录酶反转录成cdna，然后再加入特异引物对目标片段进行扩增，扩增产物的分析与一般pcr类似；反转录酶： amv和 momlv反转录酶反转录引物：随机引物、oligo dt、特异性引物用途：检测基因表达水平；检测rna病毒（三）多重 pcr在同一反应中采纳多对引物同时扩增几个不同的dna片段的方法；优点：多个致病基因同时检测；（四）定量 pcr实时荧光定量pcr在 pcr反应体系中

10、加入反应pcr扩增进程的荧光染料或荧光标记探针，实时监测 pcr过程中荧光信号的变化，通过参照基因或标准曲线对起始模板dna的浓度进行精确定量分析；实时荧光定量pcr原理.如何对起始模板定量？通过 ct 值和标准曲线对起始模板进行定量分析三个基本概念：扩增曲线、荧光阈值、ct 值扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（cycle ）；纵坐标：荧光强度荧光染料： sybr green i核酸分子杂交原理： 核酸变性与复性核酸分子杂交技术用标记的已知序列的核酸片段（探针）来检测样品中未知核酸序列（形成异源杂交体），再经显影或显色的方法，将结合的核酸的位置或大小显示出来；核酸探针（ probe ）能与待测的

11、靶核酸序列特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核酸片段；核酸探针类型dna探针： 基因组 dna探针； cdna探针； 寡核苷酸探针rna探针核酸探针标记物放射性标记物： 32p, 3h ,35s灵敏度高 ;但存在环境污染和半衰期短等缺点；非放射性标记物 :生物素、光敏生物素、地高辛、酶、荧光素等，但灵敏度和特异性较放射性标记物差；核酸分子杂交技术应用固相杂交印迹杂交 blotting hybridization： southern blot、northern blot斑点杂交 dot hybridization原位杂交 in situ hybridization液相杂交印迹

12、杂交的一般步骤：1. 样品制备和电泳分别2. 样品变性处理、转印3. 探针制备和标记4. 预杂交与杂交5. 洗去未杂交的游离探针6. 检测杂交信号7. 结果判定与分析印迹技术（ blotting）将核酸或蛋白质等生物大分子通过肯定方式转移并固定到固相支持物上以便进一步分析的方法；1. southern blot dna检测 通过核酸切酶降解样品中dna，再经凝胶电泳分别，将分别后的dna片段从凝胶转移到吸附薄膜上并固定，随后用标记的探针进行杂交，以检测目的dna；.检测对象dnarna蛋白质凝胶种类琼脂糖琼脂糖聚丙烯酰胺预处理（变性剂）限制性酶切naoh甲醛热变性sds检测探针dnacdna抗

13、体步骤： 1.dna 片段分别变性 2.dna 片段转移与固定 3. 杂交反应 4. 杂交信号检测2. northern blot（ rna检测）rna 经变性凝胶电泳分别后，转移固定到固相支持物上，与标记的探针杂交并检测；（分析基因的转录和mrna分子的大小） ；3. western blot（蛋白检测）基本原理： 通过电泳区分不同的蛋白组分，并转移至固相支持物，对靶蛋白（抗原）进行检测；也称为免疫印迹（通过特异性抗体作为探针，immunoblotting）；主要用途：1.鉴定蛋白质表达情形2.比较不同样本中特定蛋白质相对表达量3.分析蛋白 - 蛋白间相互作用 蛋白质组学讨论 三种印迹技术的

14、共同点基本步骤相同（电泳、转印、杂交反应、杂交信号检测） 三种印迹技术的不同点southern blotnorthern blotwestern blot原位杂交： 在保持细胞形状的条件下，检测与探针互补的核酸序列在细胞的空间位置；荧光原位杂交采纳荧光标记的探针与待测样本中的核酸进行原位杂交，从而检测核酸序列在组织或细胞中的定性、定位及相对定量；遗传性疾病的产前诊断荧光原位杂交挑选21 三体（间期） fish 检测白血病细胞 bcr-abl融合基因荧光原位杂交检测上皮细胞中人乳头瘤病毒的感染基因芯片 gene chip. 将大量探针有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探针，然后

15、与标记的待测核酸样品进行杂交，通过对探针分子杂交信号强度的分析来获知样品中相应分子的数量和序列信息；. 由于常用运算机硅芯片作为固相支持物，所以称为基因芯片；蛋白质芯片. 高通量的蛋白质功能分析技术，用于分析蛋白质表达谱，讨论蛋白质间或蛋白质与其他分子间相互作用，挑选药物作用蛋白靶点；. 基本原理：将各种蛋白质有序地固定于载体上成为检测用的芯片，然后用标记的蛋白质或其他成分与芯片作用，洗去未结合的成分，再利用扫描技术测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质间或蛋白质与其他分子之间的相互作用关系；三、基因克隆、表达和调控基因克隆 五个基本部分：一、目的 dna的分别猎取（分） ； 二、载体的挑选与

16、限制酶切（切）； 三、目的 dna与载体连接（连） ； 四、重组 dna转入受体细胞（转） ；.五、重组体的挑选与鉴定（筛） ；（一）目的基因的获得化学合成基因组文库与 cdna文库：包含全面的基因和mrna信息基因组文库（ genomic library， g-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组dna克隆群；cdna文库（ cdna library， c-文库）以细胞全部 mrna经逆转录，制备出全套的cdna克隆集合；利用 pcr及 rt-pcr扩增技术合成序列已知的基因其它技术（二）目的基因与表达载体的重组载体（ vector ）： 携带外源 dna进入宿主细胞进行扩增或表达的

17、工具；按功能分： 克隆载体；表达载体多克隆位点（ mcs）： 一段人工合成的 dna序列，含有密集排列的多种限制性切酶识别序列，以便不同来源的外源dna片段插入载体；1. 限制性核酸切酶识别双链 dna分子中特异核苷酸序列的一类核酸切酶，为原核生物所特有；分类：、类基因工程技术中常用的是类（分子剪刀），识别位点与切割位点序列特异，且在识别序列切割2. dna连接酶（基因工程的“缝纫针”）一种封闭 dna链上缺口的酶，催化dna链相邻的 3羟基与 5磷酸基团生成磷酸二酯键；3、目的基因与载体重组及其策略 一粘性末端连接缺点：载体自身环化；双向插入；碱性磷酸酶（ alp）催化去除 dna、rna或

18、 dntp上的 5 - 磷酸基团；主要用途有：防止载体dna自身环化，提高重组效率；（二） 定向克隆：使目的基因按正确方向插入载体中的方法；定向克隆的两种连接方式：粘粘连接：粘平连接（三）人工接头 linker化学合成的含一种或多种限制酶切位点的平端双链寡核苷酸片段；本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点（四）同聚物加尾连接本法适用于在载体和目的基因上没有相同的限制酶切位点（五） pcr引入粘性末端后连接可在 pcr扩增目的基因时将限制性酶切作用位点人为添加到引物的5末端；以目的基由于模板， 经 pcr扩增获得带有引物序列的目的基因，用相应的限制性核酸切酶切割后，产生粘性末端，随后

19、与载体（也经相应的限制性核酸切酶切割）进行粘性末端连接；基因克隆中常用的工具酶1、限制性核酸切酶用于切割dna片段2、dna连接酶用于催化dna片段连接3、碱性磷酸酶去除核酸分子末端的磷酸基团4、末端转移酶介导dna末端加尾，产生限制酶切作用位点5、dna聚合酶常用于pcr扩增 dna6、逆转录酶以rna为模板合成 cdna转化： 将重组质粒导入受体细胞转染或称为转导： 将噬菌体重组子或病毒重组子导入受体细胞质粒： 是在细菌除染色体之外的能自主复制到的共价闭合环状双链dna，随着细菌分裂能够稳固地把自己的遗传特性传递给子细胞；重组体的挑选和鉴定阳性克隆：含有目的基因的宿主细胞克隆；挑选出含有重

20、组 dna目的基因 +载体 的克隆阳性克隆的挑选方法（一）针对载体携带的挑选标记依据遗传表型进行挑选抗生素抗性挑选 遗传标记补救挑选噬菌斑挑选（二）针对重组体结构和表达产物挑选基因工程技术的应用：1. 制备基因组文库、cdna文库、核酸探针、基因工程药物、疫苗及抗体2. 制造转基因动植物（改良生物性状）3. 基因诊断、基因治疗基因工程生产胰岛素药物流程：1，目的基因的猎取：通过各种手段（基因组文库，化学合成，pcr技术等）猎取胰岛素基因；2，基因表达载体的构建：用限制酶切割质粒和目的基因（胰岛素基因）使产生不同的粘性末端，再用 dna连接酶使质粒和胰岛素基因连接形成重组质粒；3，将重组质粒导入

21、受体细胞（如大肠杆菌，用感受态细胞法即cacl2 转化法），挑选阳性重组体；4，将含有胰岛素基因的阳性重组体在宿主细胞进行诱导表达、检测、并纯化表达产物；rna干扰 ： 在生物体细胞，双链rna分子诱导同源 mrna特异性降解，导致基因表达抑制， 又称转录后基因缄默；rna干扰作用机制（1） sirna 形成： dsrna被 dicer酶剪切成 sirna（2） risc rna-induced silencing complex形成（3） risc 活化： sirna 解旋成为单链，无活性的risc 转变成活性形式 包含 sirna 反义链（4） 诱导靶 mrna降解：在 sirna 反义链

22、引导下， risc 识别并切割与 sirna 反义链互补的靶 mrna（5） dsrna的再生成细胞中存在两种 rna干扰现象：sirna 小干扰 rna：21-23nt ，由长 dsrna裂解而成的小片段， 可诱导 mrna降解；sirna主要参加抵挡外源性病毒核酸的侵染；mirna 微小 rna：约 22nt ，由 mirna前体剪切而成，可抑制mrna翻译； mirna 主要参加源性基因的表达调剂；sirna 小干扰 rnamirna 微小 rna来源结构sirna 是外源性的，是 rna干扰的中间产物sirna 是双链 rnamirna是源的是生物体固有mirna是单链 rnadice

23、r酶加工过程作用位置对称地来源于双链rna不对称加工，仅剪切mirna的侧臂sirna 可作用于 mrna的任何部位mirna 主要作用于靶标基因译区（ 3 -utr）3 端非翻作用方式sirna 一般导致靶 mrna的降解，即为转录水平后调控；作用阶段sirna 不参加生物生长，主要作用是抑制病毒感染mirna可抑制靶 mrna的翻译，也可以导致靶 mrna降解，即在转录后水平和翻译水平起作用mirna 主要在发育过程中起作用，调剂源基因表达rna干扰技术的应用基因治疗（基因失活性治疗）（1） 病毒感染性疾病：通过rnai 抑制 rna 病毒的复制（2） 基因过表达引起的疾病（如肿瘤）： s

24、irna 药物基因功能讨论（功能失活策略）基因失活性治疗：将特定的反义核酸（反义rna、反义 dna）、核酶、 sirna、mirna等导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的反常表达；基因失活性治疗面临的问题：1.药物的稳固性 2.药物的安全性 3.药物的转运载体基因靶向： 利用同源重组原理对生物细胞特定的源基因进行改造的技术；基因敲入： 外源功能基因与宿主基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中， 从而在细胞获得表达；基因敲除： 宿主基因组中特定功能靶基因的部分片段被同源的外源dna片段替代， 从而使靶基因失活第七章 药物基因组学药物基因组学： 是讨论遗传变异与药物反应相互关系的一门

25、学科，以提高药物的疗效及安全性为目标；单核苷酸多态性 snp ： 在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性；snp:是 rflp、str之后的第三代遗传标记；snp特点： 1.最常见可遗传变异； 2.数量多分布广； 3.具有遗传稳固性； 4.具有二态性，易于自动化规模化分析；5.可直接影响基因功能snp检测技术： 1. pcr技术； 2.核酸杂交技术； 3.生物芯片技术； 4. dna 测序技术；单体型： 位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态组合；遗传变异与药物应答（一）基因多态性与药物代（二）基因多态性与药物转运（三）基因多态性与药物效应靶分子基因分型指导临床用药随着药物基因组学讨论对多种基因多态性与药物应答关系的逐步阐明，随着各种基因检测和基因分型技术的快速进展，特殊在肿瘤、 心血