基因工程的基本操作程序(上课)

1、 1.1DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.3基因工程的应用基因工程的应用1.4蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起本节知识体系本节知识体系基因工程的基本操作程序：基因工程的基本操作程序：一、目的基因的获取一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构原核细胞基因原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的编码区（编码序列）：能指导有

2、关蛋白质的合成，即合成，即能够编码蛋白质能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的编码区下游的DNA序列，序列，不能不能转录并不能编码蛋白质转录并不能编码蛋白质，但有调，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，控遗传信息表达的核苷酸序列，如如启动子、终止子启动子、终止子等等原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构 RNA RNA聚合酶的作用是催化聚合酶的作用是催化DNADNA转录为转录为RNARNA。它能够识别它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，。转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNA

3、DNA分子移动，并与分子移动，并与DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。 RNARNA聚合酶聚合酶是催化以是催化以DNADNA为模板（为模板（templatetemplate）、三磷酸）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNARNA的酶。的酶。因为在细胞内与基因因为在细胞内与基因DNADNA的遗传信息转录为的遗传信息转录为RNARNA有关，所以有关，所以也称转录酶。也称转录酶。 真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核细胞基因真核细胞基因编码区编码区（间隔、不连续）（间隔、不连续）外显子外显子：能能编码蛋

4、白质编码蛋白质的的DNA序列序列内含子内含子：不能不能编码蛋白编码蛋白质的质的DNA序列序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子动子、终止子真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做其中，能够编码蛋白质的序列叫做

5、外显子外显子，一般不，一般不能够编码蛋白质的序列叫做能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子。原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是连续连续的的编码区是编码区是间隔间隔的、不连续的的、不连续的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的编编码区码区和具有调控作用的和具有调控作用的非非编码区编码区组成的组成的编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构基因结构一样长一样长吗？吗？基因的种类基因的种类（1）编码蛋白质的编码蛋白质的基因：包括结构基因和基因

6、：包括结构基因和调节基因。调节基因。（2）没有翻译产物的没有翻译产物的基因：如基因：如rRNA基因基因和和tRNA基因。基因。（3）不能转录的不能转录的DNA片段：如操纵基因。片段：如操纵基因。启动子与终止子 启动子启动子是在非编码区内紧靠转录起点，是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。使转录从起点开始，沿编码区进行。 终止子终止子是在非编码区内紧靠转录终点，是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它调控遗

7、传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。模板链上脱离下来，使转录终止。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为物的不同基因，称为基因文库基因文库。1. 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNA

8、文库）文库）1. 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因某生物体内全部某生物体内全部DNA DNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体 限制酶限制酶 与表达载体连接与表达载体连接 导入导入基因组文库基因组文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNAcDNAcDNA 反转录反转录受体菌群体受体菌群体 与表达载体连接与表达载体连接 导入导入部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取cDNA为具有与为具有与某某RNA链呈互链呈互补的补的碱基碱基序列序列的的单链单链DNA即即comp

9、lementary DNA之缩写之缩写 某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接与运载体连接 导入导入cDNA文库文库基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取1. 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因比较：部分基因文库和基因组文库 原理：原理： 前提：前提： 过程：过程：PCR扩增仪扩增仪DNA双链复制的基本原理双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列1. 目的基因目的基因DNA受受热变热变性解链为单链；性解链为单链；2. 引物引物与单链互补结合；与单链

10、互补结合；3. 合成链在合成链在DNA聚合酶聚合酶作用下进行作用下进行延伸延伸。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因由由穆里斯穆里斯等人于等人于1988年发明，并于年发明，并于1993年获得诺贝尔化学奖。年获得诺贝尔化学奖。PCR全称为全称为多聚酶链式反应多聚酶链式反应（polymerase chain reaction)1.1.变性变性：加热至：加热至909095 95 目的基因目的基因DNADNA解解链链; ;2.2.复性复性：冷却至：冷却至55556060，引物结合到互，引物结合到互补补DNAD

11、NA链链; ;3.3.延伸延伸：加热至：加热至70707575，热稳定热稳定DNADNA聚聚合酶合酶从引物起始互补从引物起始互补链的合成链的合成 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶高温下变性解旋高温下变性解旋

12、解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制(PCR扩增仪内扩增仪内)主要在细胞核内主要在细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）酶）大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子解旋酶、解旋酶、普通的普通的DNADNA聚合酶等聚合酶等基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取3. 人工合成：反转录法等人工合成：反转录法等 基因比较基因比较小小 已知其已知其核苷酸核苷酸序列序列 已知其已知其mRNA 的序列的序列 已知其翻译产物的已知其翻译产物的氨基酸氨基酸序列序列蛋白质的氨蛋白质的氨基酸序列基酸序列mRNAmRNA的核苷的核苷酸序列酸序列

13、基因的脱氧基因的脱氧核苷酸序列核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成 生物材料生物材料DNA目的基因的获取目的基因的获取mRNAcDNAPCR反转录反转录cDNA文库文库DNA一定大小范一定大小范围的围的DNADNA基因组文库基因组文库人工合成人工合成限制酶切限制酶切自然界中分离自然界中分离人工方法合成人工方法合成自然界分离后自然界分离后再人工合成再人工合成归纳归纳基因比较小，且基因比较小，且已知核苷酸序列已知核苷酸序列基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的构建基因文库是获取目的基

14、因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCRPCR方式从方式从含有该基因的生物的含有该基因的生物的DNADNA中，直接获得，也可以通过反转录，用中，直接获得，也可以通过反转录，用PCRPCR方式从方式从mRNAmRNA中获得，不一定要构建基因文库。但中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种

15、生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的想得到一种生物的全基因组序列全基因组序列，往往就需要构建基因文库。，往往就需要构建基因文库。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取一、目的基因的获取寻根问底寻根问底为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建-基因工程的核心基因工程的核心使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体

16、细胞中稳定稳定存在并存在并遗传遗传给下一代给下一代同时使目的基因能同时使目的基因能表达表达和和发挥发挥作用。作用。1.构建基因表达载体的目的构建基因表达载体的目的2. 基因表达载体的组成基因表达载体的组成a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因e、复制原点、复制原点它们各有什么作用？它们各有什么作用？基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建-基因工程的核心基因工程的核心2. 基因表达载体的组成基因表达载体的组成a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因e、复制原点、复制

17、原点一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾部，起片段，位于基因的尾部，起终止转录的作用终止转录的作用为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来有目的基因的细胞筛选出来（如抗氨苄青霉素基因，（如抗氨苄青霉素基因，绿色荧光基因）绿色荧光基因） 它们各有什么作用？它们各有什么作用？外来的编码特定蛋白质的基因外来的编码特定蛋白质的基因DNA复

18、制起点，即复制起点，即DNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点 用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现两个切质粒，使其出现两个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3.3.基因表达载体的构建的步骤基因表达载体的构建的步骤将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _ _处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作

19、程序二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建质粒质粒一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶DNADNA分子分子基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建-基因工程的核心基因工程的核心寻根问底寻根问底作为基因工程表达载体，只需含有目的基作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？因就可以完成任务吗？为什么？不可以不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需。因为目的基因

20、在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，需要使用生物之间进行基因交流，需要使用启动子和终止子启动子和终止子才能比较才能比较有利于基因的表达。通过有利于基因的表达。通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；只将编码序列导入受体生物中无法转录；（2） 目的基因是否导入受体生物中需要有目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记筛选标记；（3）为了增强目的基因

21、的表达水平，往往还要增加一些其他调控）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如元件，如增强子增强子等；等；（4） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以往往要加上可以标识存在部位的基因标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建-基因工程的核心基因工程的核心寻根问底寻根问底将生物的所有将生物的所有DNA直接导入受

22、体细胞不是直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？更简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：提示：有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。讲不算基因工程。基因工程的基本操作程序基因工程的基

23、本操作程序三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化转化目的基因进入目的基因进入 内，并且在受体细胞内，并且在受体细胞内维持内维持 和和 的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法（最常用（最常用80%80%）基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法Ca2+ 处理法处理法1.1.将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1 1）农杆菌感染特点：）农杆

24、菌感染特点：（2 2）转化原理：）转化原理：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 易感染易感染双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物( (对大多数单子叶植对大多数单子叶植物没有感染能力）。物没有感染能力）。 当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的的TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA（插入目的基因也可转移）可转移（插入目的基因也可转移）可转移至受体细胞的染色体至受体细胞的染色体D

25、NADNA上。上。1.1.将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（3 3）转化过程：）转化过程：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞 目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 农杆菌导入植物细胞农杆菌导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体整合到受体细胞的染色体DNADNA上上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基

26、因导入单子叶植物的原你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？因吗？原因：原因：根瘤农杆菌具有根瘤农杆菌具有趋趋 化性化性，即植物的受伤组织会产，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮乙酰丁香酮和和羧基乙酰丁羧基乙酰丁香酮香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易不易被根瘤被根瘤农杆菌侵染的原因。农杆菌侵染的原因

27、。 酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物趋化物，又可以作为农杆菌中又可以作为农杆菌中Ti质粒上质粒上Vir区（毒性区）基因的区（毒性区）基因的诱诱导物导物，使，使Vir区基因活化，导致区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从的加工和转移，从而侵染植物细胞。而侵染植物细胞。寻根问底寻根问底 基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNADNA打入受体细胞中，使目的打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。基因与其整合并表

28、达的方法。将目的基因导入植物细胞的将目的基因导入植物细胞的其他其他方法：方法：单子叶植物单子叶植物中常用的一种基因转化方法中常用的一种基因转化方法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加剪去柱头，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使目的基因借助花（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。粉管通道进入受体细胞。将目的基因导入植物细胞的将目的基因导入植物细胞的其他其他方法：方法：2.2.

29、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射技术）方法：显微注射技术（最常用、最有效）（最常用、最有效）（2 2）转化过程：）转化过程：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞发育成新性状动物发育成新性状动物显微注射显微注射取卵（受精卵）取卵（受精卵）目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯受精卵发育、移植受精卵发育、移植3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞（1 1）原核生物作受体细胞的优点）原核生物作受体细胞的优点（2 2）转化过程：）转化过程：基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序三、

30、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。（应用最为广泛（应用最为广泛-大肠杆菌）大肠杆菌）受体细胞受体细胞（大肠杆菌）（大肠杆菌）感受态细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子完成转化过程完成转化过程Ca2+处理细胞处理细胞细胞处于一种能吸细胞处于一种能吸收周围环境中收周围环境中DNA分子的生理状态分子的生理状态1.1.检测与鉴定的目的检测与鉴定的目的2.2.基本思路基本思路基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定四、目

31、的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功检查基因工程是否做成功 确定目的基因进入受体细胞后，是否可以确定目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定稳定维持维持和和表达表达其遗传特性。其遗传特性。检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上上是否插入是否插入了了目的基因目的基因检测目的基因检测目的基因是否转录是否转录出了出了mRNAmRNA个体个体生物学水平的鉴定生物学水平的鉴定检测目的基因检测目的基因是否翻译是否翻译成成蛋白质蛋白质方法方法DNA分子杂交分子杂交方法方法分子杂交分子杂交（RNA/DNA杂交）杂交）方法方法抗原抗原-抗体杂交抗体杂交抗虫鉴定、抗病鉴定、抗虫鉴定、抗病

32、鉴定、活性鉴定等活性鉴定等检测检测鉴定鉴定基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功检查基因工程是否做成功DNADNA分子杂交技术检测分子杂交技术检测 被检测的转基因生物的基因组被检测的转基因生物的基因组DNA被放射性标记的含目的基因被放射性标记的含目的基因DNA片段的探针片段的探针如果最后出现如果最后出现“杂交带杂交带”，则表明目的基因已插入受体，则表明目的基因已插入受体DNA中中基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功检查基因工程是否做成功R

33、NA/DNA分子杂交技术检测分子杂交技术检测与被检测的转基因生物的提取出的与被检测的转基因生物的提取出的mRNA混合混合被放射性标记的含目的基因被放射性标记的含目的基因DNA片段的探针片段的探针如果最后出现如果最后出现“杂交带杂交带”，则表明，则表明目的基因转录出了目的基因转录出了mRNAWestern杂交：蛋白质分子（抗原杂交：蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交。抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质蛋白质；第二步，将表达出的

34、蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体，并提取出抗体（一抗）；抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取第三步，从转基因生物中提取蛋白质蛋白质，走凝胶电泳；，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合特异结合。由于这种抗原由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称抗体的

35、结合显示不出条带，所以加入一种称为为二抗二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记特殊的标记。如果转基因生物的目的基因表达出了如果转基因生物的目的基因表达出了特定蛋白质特定蛋白质，则结果为，则结果为阳性阳性。基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功检查基因工程是否做成功抗原抗原- -抗体杂交技术检测抗体杂交技术检测基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功检查基因工程是否做成功个体生物学水平的鉴

36、定个体生物学水平的鉴定鉴定个体生物学特性是否达到预期鉴定个体生物学特性是否达到预期：如植物个体的抗虫性或抗病性：如植物个体的抗虫性或抗病性如：通过抗虫或抗病的如：通过抗虫或抗病的接种实验接种实验， 确定植物个体确定植物个体是否具有抗性是否具有抗性以及以及抗性的程度抗性的程度。又如：通过生物个体产品功能活性的又如：通过生物个体产品功能活性的比较实验比较实验， 确定转基因产品的确定转基因产品的功能活性功能活性是否与天然产品是否与天然产品相同相同。基因工程的基本操作流程归纳: 基因工程的基本操作程序1.1. 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCRu 化学方法人工合成

37、化学方法人工合成2.2. 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3. 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法处理法4.4. 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u 鉴定：鉴定：个体生物学水平的鉴定个体生物学水平的鉴定1.1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并

38、发挥作用，还需要有其不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主必须构建上述元件的主要理由是：要理由是：（1 1） 生物之间进行基因交流，需要使用生物之间进行基因交流，需要使用启动子启动子才能比较有利于基因的才能比较有利于基因的表达。表达。如通过如通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中，此目的基因无法进行转录；受体生物中，此目的基因无法进行转录；（2 2） 目的基因是否导入受体生物中需要有目的基因是

39、否导入受体生物中需要有筛选标记筛选标记；（3 3） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如如增强子增强子等；等；（4 4） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以往要加上可以标识存在部位的基因标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等，如绿色荧光蛋白基因等 2.2.若想将一个抗病基因导入单子叶植物（如小麦），从若想将一个抗病基因导入单子叶植物（如小麦），从理论上说，你认为应该怎样做？理论上说，你认为应该怎样做？ 如果想将一个抗病基因转入

40、小麦，也可以用农杆如果想将一个抗病基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的和激活农杆菌的VirVir区（诱导性）的基因，使区（诱导性）的基因，使T-DNAT-DNA转转移并插入到染色体移并插入到染色体DNADNA上。上。3.3.利用大肠杆菌可以

41、生产出人的胰岛素，联系前面有关细利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链糖链，这些糖链是，这些糖链是在在内质网和高尔基复合体内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细大肠杆菌不存在这两种细胞器胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是，

42、因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能不可能的。的。基本操作如下：基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆

43、菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明则表明-珠蛋白基因已进入其中。珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取取-珠蛋白。珠蛋白。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？1. 1. 有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的