青海省高原地区致儿童病毒性脑炎肠道病毒监测结果分析

1、青海省高原地区致儿童病毒性脑炎肠道病毒监测结果分析卢因因 李红 赵生仓 姜双应青海省疾病预防控制中心摘要：口的了解引起青海省高原地区儿童病毒性脑炎肠道病毒的流行病学特征和病原 谱构成。方法 选择青海省监测点2010-2015年报告的病毒性脑炎患儿以及临床 诊断病毒性脑炎患儿共256例，采集患儿脑脊液标本，提取核酸，采用 real-timepcr方法检测肠道病毒通用型(ev)核酸阳性脑脊液标木均做分型试 验，分别检测肠道病毒71型(ev71),肠道病毒柯萨奇16型(ca16)和肠道病 毒埃可30型(eci1030)病毒的核酸。将肠道病毒未分型脑脊液标本接种人横纹 肌肉瘤细胞(rhabdomyos

2、arcoma cell, rd)进行培养。提取核酸，采用半巢式 聚合酶链反应(sn-pcr)对肠道病毒vp1区进行特界性扩增和基因测序，通过 blast确定肠道病毒类型。结果256例病毒性脑炎患儿中男169例，女87例，男 女比例为1.94 ： 1;肠道病毒通用核酸阳性22例，检出率&95%,其中以5-10 岁居多(17例),占81.82%。青海省高原地区肠道病毒性脑炎病例主要集屮在 夏秋季(7-11月)，占67. 19%o肠道病毒通用阳性的22份标本中ech030核酸 阳性17份，占77. 27%;ev71和ca16核酸阳性各1份。3份未分型标本经vp1区 基因序列测定分析，相关序列

3、同源性为97%99%,分别确定为c0xb4、coxb5和 ech06。结论引起青海省高原地区儿童病毒性脑炎的肠道病毒以ech030为主， ev7k ca16、c0xb4、c0xb5、ec1io6 感染病例散发存在。关键词:儿童;病毒性脑炎;肠道病毒;脑脊液;高原地区;作者简介：卢gjgj (1981-),女，江苏人，硕士，副主任检验技师，主要从事 病原微生物检验。e-mai 1:qhlunannan163. com收稿日期：2017-07-06基金：国家科技重大专项传染病监测技术平台项目(no. 2012zx10004-208)analysis of enterovirus surveilla

4、nce data from pediatriepatients with viral encephalitis on the qinghai plateaulu nan-nan li hong zhao sheng-cang jiangshuang-yingqinghai center for disease control andprevention;abstract：objective to investigate the epidemiological characteristies and the spectrum of enteroviruses preveilent in chil

5、dren with viral encephalitis on the qinghai platcau. methods a total of 256 podiatrie paticnts with viral encephalitis were reported from surveillance sites in qinghai from 2010 to 2015. cerebrospinal fluid samples were collected and nucleic acids were extracted. real-time pcr with universal primers

6、 was used to detect nucleic acids of enteroviruses. all positive specimens were typed for nucleic acids of enterovirus 71 (ev71) , coxsackie 16 virus (cai6) , and echo 30 virus. specimens that could not be typed were inoculated into human rhabdomyosarcoma cells (rd) for culturing. nucleic acids were

7、 extracted from the cel 1 cul lure supernatant. a semi-nested polymerase chain reaction (snrpcr) was used for specific amplification of the vp1 region of enteroviruses and the obtained sequences were subjeeted to blast for enterovirus classification. results in 256 pediatric patients with encephalit

8、is, the ratio of males to females was 1. 94 : 1. an enterovirus was detected at a rate of 8. 95% and enteroviruses mainly infected chiidren ages 510 (81. 82%) . on the qinghai pleiteau, infection with an enterovirus mainly occurred in the summer and autumn (from july to november, 67.19% of cases) of

9、 22 specimens testing positive for an enterovirus, 17 (77. 27%) were positive for the echo 30 virus, 1 was positive for ev71, and 1 was positive for ca16. analysis of the vp1 gene of 3 unclassified specimens indicated a 97%-99% similarity to c0xb4, c0xb5, and ech06. conclusion the main cause of vira

10、l encephalitis among pediatric patients wasech030. sporadic cases of viral encephalitis were also caused by ev71, ca16, c0xb4, c0xb5, and ech06.keyword：pediatrie; viral encephalitis; enterovirus; cetebtospinal fluid; plateau region;received： 2017-07-06人类肠道病毒(enterovirus ev)是小rna病毒科肠道病毒属的成员，具有120 多个血

11、清型，肠道病毒主要导致无症状感染或引起发热等症状，可引发脊髓灰 质炎、无菌性脑炎、手足口病、心肌炎等疾病山。病毒性脑炎是儿童时期常见 中枢神经系统感染性疾病之一，而ev是引起病毒性脑炎主要的病原体及1，在 我国肠道病毒感染占病毒性脑炎、脑膜炎的69%84%3-4。木研究采集青海省 高原地区的256例确诊病毒性脑炎患儿的脑脊液标本，进行肠道病毒检测及分 型，探讨引起青海省高原地区儿童病毒性脑炎肠道病毒的病原谱。材料与方法1病例青海省红十字医院和青海省妇女儿童医院收治的病毒性脑炎患儿256例，均依 据文献5 病毒性脑炎诊断标准确诊。2样本采集与处理采集患儿脑脊液标本，在冷藏条件下运送至实验室，置-

12、70°c冰箱保存，24h检 测的标木置jc冰箱保存。标木避免反复冻融。3病毒检测3. 1 ev rna的提取采用 qiagen 公司 qiaamp minelute virus spin kit (cat. n057704)提取病毒 核酸，按说明书步骤操作，提取的核酸-70°c冰箱保存。3.2 real-time pcr 检测采用江苏硕士生物科技有限公司的成套试剂盒，按说明书方法对256份脑脊液 标本进行肠道通用型检测，肠道病毒通用阳性的标本再检测肠道病毒(ev71) 型、肠道病毒(ca16)型、肠道病毒埃可30型。3. 3未分型标本的病毒培养将0.2ml未分型脑脊液标木接

13、种到rd细胞上，置35°c. 5%c02条件下培养，当 细胞病变达+以上时收获病毒，-70°c保存。3. 4 rt-pcr和vp1区序列测定 以提取的病毒核酸为模板，采用takara公司生产的one-step rna pcr kit （amv） 试剂盒进行rt-pcr,扩增和测序引物参照文献6,由上海牛物科技有限公司 合成。vp1区序列测定采用半巢式聚合酶链反应（snpcr）方法，扩增和测序引 物见表 1。sn-pcr 试剂为 takara 公司生产的 q5 llotstart high-fidelity dna polymeraseo3.5 pcr产物琼脂糖凝胶电泳分析与

14、回收pcr产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下观察，目的片段理论大小为 370bpo采用takara公司生产的胶冋收试剂冋收pcr产物，操作按试剂说明书方 法进行。3. 6核昔酸测序分析pcr产物测序由上海生工生物科技有限公司完成，利用ncb1, blast软件进行序 列比对分析。表 1 sn-pcr 法检测人肠道病毒引物 table 1 sn-pcr detection of human enteric virus primers下载原表结果1肠道病毒通用核酸检出率265例病毒性脑炎患儿肠道病毒通用核酸检测阳性22例，检出率& 59%o2病例分布2.1病毒性脑炎患儿性别、年

15、龄分布256例确诊病毒性脑炎患儿其中男169例，女87例，男女比例为1.94 : 10病毒 通用核酸阳性者中0-4岁4例，占18.18%;其中5-10岁18例,占81.82% （表2） o表2 256例病毒性脑炎患儿肠道病毒通用核酸阳性年龄分布table 2 256cascs of viral encephalitis in children with enterovirus univetsal nucleic acid positive age distribution下载原表2. 2病毒性脑炎发病时间分布 病毒性脑炎患儿及肠道病毒核酸检测阳性病例主要出现在7-11刀份，分别占 67. 19

16、% (172/256)(表 3)。3肠道病毒分型检测对肠道病毒通用型核酸阳性的22份标本做分型检测，其屮ecii030核酸阳性17 份,ev71核酸阳性1份，ca16核酸阳性1份，未分型3份，分别占77. 27%.4. 55%、4. 55%和 13. 63%。4未分型肠道病毒核昔酸序列测定对3份肠道病毒未分型标本经细胞培养后分离的毒株进行核昔酸测序，测序结 果通过blast系统与genbank进行比对，c0xb4、c0xb5、ecii06核廿酸同源性分 别为 98%99%、99%和 97%、99%。表3 256例病毒性脑炎患儿发病时间分布table 3 256cases of viralen

17、cephal it is in chi ldre n distributi on on set下载原表讨论引起病毒性脑炎病毒种类繁多iii。高原地区引起病毒性脑炎的病原体主要为肠 道病毒，约占75%宜。木研究结果显示青海省高原地区儿童肠道病毒性脑炎病 原体以ech030为主，约占77. 27%,与dos santos等卫1报道全球肠道病毒性脑 炎暴发调查结果相一致。近年來eci1o3o在全世界各地广泛流行，包括美国、加 拿大、法国、意大利、徳国、英格兰、h本、韩国、印度，我国大陆及我国台湾 地区均有报道10-11。我国是ech030型病毒性脑炎高发区，山东、江苏、浙江10、甘肃11均有报道。从

18、年龄结构来看，高原地区肠道病毒引起的脑炎主要 发生在10岁以下儿童，以510岁居多，占肠道病毒通用核酸阳性病例的 81.82%,而广州地区肠道病毒引起的儿童病毒性脑炎的年龄3岁虫1，可能与 高原地区所处的海拔、紫外线强度、气候条件、自然环境等多种因素与南方省份 不同有关，有待进一步研究。木研究中肠道病毒所致的儿童病毒性脑炎病例均出现在厂11月，与病毒性脑炎 和脑膜炎多发生于611月的报道一致13-15。可能与肠道病毒以粪-口途径传 播，夏秋季外界环境温度较高，肠道病毒在体外的存活时间较长而易传播有关。ev71和ca16引起的病毒性脑炎在高原地区已有报道，ech06病毒感染可以引起 儿童无菌性脑

19、膜炎的暴发或流行16-18。我国自2005年报道由ech-06病毒感 染导致安徽省儿童无菌性脑膜炎暴发流行31以来相继有多起类此报道 20-22 o coxb4病毒可以引起无菌性脑炎図l coxb5病毒可引起无菌性脑炎， 山东、安徽、浙江及河南省也有cvb5引起的无菌性脑炎散发的报道24-26 o本 研究发现高原地区存在由ech06、c0xb4和c0xb5感染引起的儿童病毒性脑炎病 例，但由于病例数较少，是否为输入性病例有待进一步研究。通过对青海省高原地区256例病毒性脑炎患儿脑脊液的检测结果分析看出，引 起高原地区儿童病毒性脑炎的肠道病毒以ec11030为主，ev71、ca16、c0xb4、

20、c0xb5 和ech06感染病例散发存在，可为当地肠道病毒性脑炎的监测和防治提供参考。参考文献1 卢回回，李红，赵牛仓，等sn-pcr在脑脊液中未知肠道病毒鉴定中的应用 j 中国病原生物学杂志,2017, 12 (4) : 325-7.2 rhoadesre, tabor-godwin jl, tsueng g, et al. entero-virus infections of the central nervous systemj. virology, 2011, 411 (2) :288-3053 陈宗波，范希文，董永绥，等山东地区肠道病毒中枢神经系统感染187例 分析j中华儿科杂志，2

21、003, 41 (3) : 199-202.4 黄学勇，郭万中，马宏，等.2009年河南省肠道病毒71型基因组特征分析 j中华预防医学杂志，2010, 44 (5) :469-71.5 胡亚美，江载芳，诸福棠实用儿科学m. 7版.北京:人民卫生出版社.6 nix wa, oberste ms, pallanch ma. sensitive, seminested pcr amplification of vplsequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original specime ns j.

22、j cl in microbiol, 2006, 44 (8) : 2698-704.7 gutienez km, prober cg encephalitis. identifying the specific cause is key to effective managementj. postgrad med, 1998, 103 (3) :123-5.8 卢李红,于娟，等西宁地区218例儿童病毒性脑炎监测结果分析j 中国妇幼保健.2012.27 (34) :5518-20.9 dos santos.gp, skraba i, olivcria d, lima a a, dcmclo m

23、 m, kmctzschc1, dacosta ev, dasilvae eenterovirus meningitis in brazil, 1998-2003j.j med virol, 2006, 78 (1) :98-104.10 陈前进，曹春远，张彦锋，等.2011-2014年中国福建龙岩市ech030型病毒 分子流行病学特征分析j 病毒学报，2016, 32 (6) : 727-32.11 陈建华，朱贞，李煜山，等甘肃省瓜州县一起由埃可病毒30引致的无菌 性脑炎疫情病原学分析j 病毒学报，2016, 32 (6) : 721-6.12 陈焕辉，陈翊，林涛广州地区儿童病毒性脑炎病原构

24、成和流行特点j广 州医药，2012, 43 (1) : 18-21.13 彭勇军，展成，殷拥军，等.病毒性脑炎早期诊断探讨j华西医学，2008, 23 (5) : 1130-1.14 陆惠芬，赵勤英，吴泉.262例儿童病毒性脑炎流行病学调查分析j.实用 预防医学，2004, 11 (1) : 100-1.15 金玉，余唯琪，薛君莉，等.小儿病毒性脑炎病原诊断与临床分析j临床 儿科杂志，2003, 21 (3) : 149-51.16 siafakas n, goudesidou m, gaitana k, el al. successful control of an echovirus 6m

25、eningit is outbreak in a neonatal intensive care unitincentral greecej. am j infect control, 2013, 41 (11) :1125-8.17 papadakis g, chibo d, druce j, et al. detection and genotyping of enteroviruses in cerebrospinal fluid in patients in victoria, australia, 2007-2013j. j med virol, 2014, 86 (9) :1609-13.18 miyoshi m, komagomc r, ishida s, et al. genomic character rization of echovirus 6casin gase ptiemening