第十章免疫学诊断

1、免疫学诊断技术免疫学诊断技术抗原及抗体的制备抗原及抗体的制备一、抗原的制备一、抗原的制备 1. 细菌抗原细菌抗原细菌培养细菌培养灭活，加热或化学方法灭活，加热或化学方法离心洗涤离心洗涤无活菌检验无活菌检验配置成配置成1亿菌量亿菌量/mL的菌悬液的菌悬液2. 细菌细菌O抗原抗原细菌培养细菌培养100孵育孵育22.5h，破坏，破坏H抗原抗原离心洗涤离心洗涤无活菌检验无活菌检验配置成约配置成约1亿菌量亿菌量/mL的菌悬液的菌悬液即为即为O抗原抗原3. 细菌细菌H抗原抗原细菌培养细菌培养0 .4%甲醛生理盐水洗刮菌苔甲醛生理盐水洗刮菌苔37水浴水浴24h或或4 35d无活菌检验无活菌检验配置成约配置成

2、约1亿菌量亿菌量/mL的菌悬液的菌悬液即为即为H抗原抗原细菌培养细菌培养0 .5%甲醛溶液洗刮菌苔甲醛溶液洗刮菌苔离心洗涤，离心洗涤，0.5%甲醛溶液甲醛溶液4 过夜过夜离心弃沉淀离心弃沉淀上清上清10,000rpm冷冻离心冷冻离心15,弃弃 沉淀沉淀上清上清40,000rpm冷冻离心冷冻离心2.5h，弃上，弃上清，沉淀悬浮于蒸馏水，即为清，沉淀悬浮于蒸馏水，即为H抗原抗原或或4. 细菌菌毛抗原细菌菌毛抗原细菌培养细菌培养30%蔗糖溶液，剧烈震荡（蔗糖溶液，剧烈震荡（620次次/分分10,000rpm离心，离心，15，弃沉淀，弃沉淀50,000rpm冷冻离心冷冻离心6h沉淀用蒸馏水悬浮，即成菌

3、毛抗原沉淀用蒸馏水悬浮，即成菌毛抗原5. 病毒抗原病毒抗原沉淀用沉淀用PBS悬浮悬浮细胞培养物或组织悬液细胞培养物或组织悬液反复冻融，反复冻融，34次次20,000rpm冷冻离心，弃沉淀冷冻离心，弃沉淀上清超速冷冻离心，或梯度离心上清超速冷冻离心，或梯度离心沉淀用沉淀用PBS悬浮悬浮收集病毒条带收集病毒条带6. 蛋白质抗原蛋白质抗原 离心分离（梯度离心），盐析（饱和硫酸铵），离心分离（梯度离心），盐析（饱和硫酸铵）， 分子筛层析，离子交换层析分子筛层析，离子交换层析7. 半抗原半抗原 载体：载体：HSA，BSA，OA，钥孔戚血蓝蛋白等，钥孔戚血蓝蛋白等 连接：多用化学方法。连接：多用化学方法。

4、 炭化二亚胺法：炭化二亚胺法：缩合剂，既能缩合氨基又能缩合羧基缩合剂，既能缩合氨基又能缩合羧基 戊二醛法：戊二醛法：以其两端的醛基与载体和半抗原的氨基以以其两端的醛基与载体和半抗原的氨基以共价键连接共价键连接 氯甲酸异丁脂法：氯甲酸异丁脂法：半抗原的羧基与载体蛋白的氨基以半抗原的羧基与载体蛋白的氨基以肽键相连肽键相连二、佐剂二、佐剂 1. 概念概念 凡能非特异性地通过物理或化学的方式与抗原结合凡能非特异性地通过物理或化学的方式与抗原结合而增强其特异免疫原性的物质。而增强其特异免疫原性的物质。 2. 作用作用 储存作用储存作用 活化巨噬细胞，促进巨噬细胞与活化巨噬细胞，促进巨噬细胞与T、B的相互

5、作用的相互作用 增强机体对抗原的特异性免疫应答，提高抗体滴度增强机体对抗原的特异性免疫应答，提高抗体滴度 3. 常用佐剂常用佐剂三、抗血清的制备三、抗血清的制备 1. 抗体产生规律抗体产生规律2. 免疫动物选择免疫动物选择3. 免疫剂量免疫剂量 家兔家兔 初次免疫：初次免疫：50200ug，加福氏完全佐剂，背部皮下多点注射。，加福氏完全佐剂，背部皮下多点注射。 再次免疫：再次免疫： 50200ug，加福氏不完全佐剂。，加福氏不完全佐剂。 豚鼠和大鼠豚鼠和大鼠 初次免疫：初次免疫：10100ug，加福氏完全佐剂，背部皮下多点注射。，加福氏完全佐剂，背部皮下多点注射。 再次免疫：再次免疫： 105

6、0ug，加福氏不完全佐剂。，加福氏不完全佐剂。 小鼠小鼠 550ug 绵羊或山羊绵羊或山羊 初次免疫：初次免疫：0.510mg，加福氏完全佐剂，肌肉、皮下或皮内多，加福氏完全佐剂，肌肉、皮下或皮内多点注射。点注射。 再次免疫：再次免疫： 0.510mg ，加福氏不完全佐剂。，加福氏不完全佐剂。 鸡鸡 初次免疫：初次免疫： 50200ug，加福氏完全佐剂，胸肌多点注射。，加福氏完全佐剂，胸肌多点注射。 再次免疫：再次免疫： 50200ug，加福氏不完全佐剂。，加福氏不完全佐剂。4. 动物采血法动物采血法5. 血清分离血清分离6. 免疫球蛋白的提取免疫球蛋白的提取四、单克隆抗体的制备四、单克隆抗体

7、的制备五、基因工程抗体的制备五、基因工程抗体的制备图8-5 B细胞杂交瘤及单克隆抗体制备过程（据杜念兴）凝聚性试验凝聚性试验 抗原与相应抗体结合形成复合物，抗原与相应抗体结合形成复合物，在电解质存在下，复合物相互凝形在电解质存在下，复合物相互凝形成肉眼可见的凝集小块或沉淀物，成肉眼可见的凝集小块或沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定抗体根据是否产生凝聚现象来判定抗体或抗原，称为凝聚性试验。或抗原，称为凝聚性试验。凝集试验凝集试验沉淀试验沉淀试验 颗粒性抗原与其相应的抗体发生特异性结合反应，颗粒性抗原与其相应的抗体发生特异性结合反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集团块在适当电解质存在下，形

8、成肉眼可见的凝集团块的试验，称为凝集试验（的试验，称为凝集试验（agglutination）。）。凝集试验凝集试验1. 直接凝集试验直接凝集试验 玻片凝集，试管凝集玻片凝集，试管凝集 2. 间接凝集试验间接凝集试验 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的不溶性颗粒表面（载体）然后再与相应的、一定大小的不溶性颗粒表面（载体）然后再与相应的抗体（或抗原）作用，在适宜电解质条件下，发生特的抗体（或抗原）作用，在适宜电解质条件下，发生特异性凝集反应，称为间接凝集试验。异性凝集反应，称为间接凝集试验。 间接血凝，乳胶凝集，碳凝集。间接血凝，

9、乳胶凝集，碳凝集。 反向间接凝集试验反向间接凝集试验3. 协同凝集试验协同凝集试验 覆盖有特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相应的抗原结覆盖有特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相应的抗原结合时，在适宜电解质条件下，发生特异性凝集反应，称为合时，在适宜电解质条件下，发生特异性凝集反应，称为协同凝集试验。协同凝集试验。 富含富含SPA的金的金 IgG类类 结合了结合了IgG类抗体类抗体 抗抗 原原 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 黄色葡萄球菌黄色葡萄球菌 抗抗 体体 的金黄色葡萄球菌的金黄色葡萄球菌 的协同凝集的协同凝集 沉淀试验沉淀试验 可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素、菌可溶性抗原（如细菌的外毒素、内毒素

10、、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等）与相应抗体结合，在适量电解质存在下，液等）与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（precipitation test）。）。 环状沉淀试验，琼脂凝胶扩散试验，免疫电泳技术环状沉淀试验，琼脂凝胶扩散试验，免疫电泳技术标记抗体技术标记抗体技术 根据抗原抗体结合的特异性和根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称标记分子的敏感性建立的技术，称为标记抗体技术（为标记抗体技术（labelled antibody techniq

11、ue）。）。 免疫检测新技术免疫检测新技术一、一、SPA检测技术检测技术 1. SPA的特性的特性 分子量为分子量为1215KD，等电点为，等电点为pH5.1，多肽单链，多肽单链，内有内有3个高度相似的个高度相似的IgG Fc端结合区，天然结构稳定。端结合区，天然结构稳定。 能与人和豚鼠、猪、兔、小鼠和猴等动物的能与人和豚鼠、猪、兔、小鼠和猴等动物的IgG结合。结合。 2. SPA的应用的应用 SPA标记技术标记技术 酶标酶标SPA，荧光素标记，荧光素标记SPA，放射性标记，放射性标记SPA 免疫球蛋白的制备免疫球蛋白的制备 亲和层析，亲和层析，SPA-Sepharose层析柱，层析柱， 洗脱

12、条件为：洗脱条件为：4mol/L尿素、尿素、 4mol/L硫氰酸盐硫氰酸盐 或或 6mol/L 鸟嘌呤盐酸盐鸟嘌呤盐酸盐二、生物素二、生物素-亲和素免疫检测技术亲和素免疫检测技术 1. 生物素与亲和素的特性生物素与亲和素的特性 生物素（生物素（biotin）：）：广泛存在于动、植物组织中的广泛存在于动、植物组织中的生长因子，也即辅酶生长因子，也即辅酶R或维生素或维生素H。分子量为。分子量为244D，生，生物素的羧基用化学方法修饰后，可制成各种活性基团物素的羧基用化学方法修饰后，可制成各种活性基团的衍生物，成为活化生物素，用于标记。的衍生物，成为活化生物素，用于标记。 亲和素（亲和素（avidi

13、n）：）：存在于鸡蛋清中的碱性蛋白，存在于鸡蛋清中的碱性蛋白，能与生物素牢固地结合。分子量为能与生物素牢固地结合。分子量为68KD，pI为为10.5，对热稳定，富含色氨酸。每个亲和素分子有对热稳定，富含色氨酸。每个亲和素分子有4个与生物个与生物素结合的位点。素结合的位点。 链霉亲和素（链霉亲和素（stretoavidin）：是）：是Streptomyces avidini 菌培养过程中产生的蛋白。菌培养过程中产生的蛋白。pI为为6.02. 生物素和亲和素的标记生物素和亲和素的标记 生物素的标记生物素的标记 标记蛋白质氨基的活化生物素：标记蛋白质氨基的活化生物素： 生物素生物素N-羟基丁二酰亚胺

14、酯（羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）、长臂）、长臂BNHS 标记醛基的活化生物素：标记醛基的活化生物素： 生物素酰肼（生物素酰肼（BHZ）、赖氨酸生物素酰肼）、赖氨酸生物素酰肼 标记蛋白质巯基的生物素：标记蛋白质巯基的生物素： 赖氨酸生物素赖氨酸生物素-丙氨丙氨-N-顺丁烯亚胺顺丁烯亚胺 亲和素的标记亲和素的标记 可用酶、荧光素等标记可用酶、荧光素等标记 3. 生物素生物素-亲和素免疫检测系统亲和素免疫检测系统 ABC法：法： Ag-Ab-Ab2-生物素生物素-亲和素亲和素-生物素生物素-酶酶 BRAB法：法：Ag-Ab-生物素生物素-亲和素亲和素-生物素生物素-酶酶 LAB法：法： Ag- Ab-生物素生物素-亲和素亲和素-酶酶三、免疫胶体金检测技术三、免疫胶体金检测技术 1. 概述概述 免疫胶体金技术是以胶体金颗粒为示踪物或显色免疫胶体金技术是以胶体金颗粒为示踪物或显色剂，用于抗原抗体检测的技术。剂，用于抗原抗体检测的技术。 胶体金是通过还原剂将氯化金分子聚合成特定胶体金是通过还原剂将氯化金分子聚合成特定大小的金颗粒，能与多种生物分子（如抗体，大小的金颗粒，能与多种生物分子（如抗体，SPA等）等）相结合，即胶体金标记物。相结合，即胶体金标记物。 2. 胶体金检测技术胶体金检测技