IPTG诱导原理

1、乳糖操纵子的诱导原理 中心法则中心法则(the central dogma)DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制基因表达基因表达(gene expression)-基因转录及翻译的过程。产生各基因转录及翻译的过程。产生各种种RNA(tRNA、mRNA、rRNA)和各种蛋白质多肽链。和各种蛋白质多肽链。RNA(tRNA、mRNA和和rRNA 基因的表达方式 根据生物对内外环境刺激的反应，将根据生物对内外环境刺激的反应，将基因表达的方式分为：基因表达的方式分为： 组成型表达 诱导和阻遏表达组成型表达组成型表达 （constitutive gene expression） 在个体发育的任一

2、阶段都能在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中在大多数细胞中持续进行持续进行的基因的基因表达，表达，无论表达的水平高或低无论表达的水平高或低，它，它受环境因素的影响较少受环境因素的影响较少、或变化或变化很小很小。 且基因表达产物通常是对且基因表达产物通常是对生命过程生命过程必需必需的、必不可少的，的、必不可少的，这类基因通常被称为持家基因这类基因通常被称为持家基因（housekeeping gene）。）。诱导和阻遏表达诱导和阻遏表达诱导诱导（induction）：）：在在特定的环境信号特定的环境信号刺激下，相应基因被激刺激下，相应基因被激活，从而使基因的活，从而使基因的表达产物增加表达产物增

3、加。这类基因称为可诱导基因。这类基因称为可诱导基因。 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导诱导 (induction)。乳糖乳糖 利用乳糖的三种酶表达利用乳糖的三种酶表达阻遏（阻遏（repression）：）：在在特定环境信号特定环境信号刺激下，相应基因被抑制，刺激下，相应基因被抑制，从而使基因的从而使基因的表达产物减少表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。这类基因称为可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏阻遏 (repression）。）。 协调表达协调表达(coordinate expre

4、ssion) 在一定机制控制下，功能上相关的一组在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需基因，无论其为何种表达方式，均需协调协调一致、共同表达一致、共同表达，使各表达产物的分子比，使各表达产物的分子比例适当，从而正常发挥功能。这种现象称例适当，从而正常发挥功能。这种现象称为协调表达为协调表达 (coordinate expression)，这，这种调节称为协调调节种调节称为协调调节 (coordinate regulation)。乳糖操纵子的结构和功能操纵子模型的提出操纵子模型的提出 1960-1961年，年，莫洛莫洛(Monod)(Monod)和雅各布和雅各布(Ja

5、cob)(Jacob)首次提出首次提出“操纵子操纵子”学说。学说。 获获19651965年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖 1940年，年， Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线二次生长曲线”。操纵子（操纵子（operon)：很多很多功能相关功能相关的的结构基因串联结构基因串联排列在染色体排列在染色体上，由一个上，由一个共同的控制区共同的控

6、制区来操纵这些基因的表达，包含这些结构基来操纵这些基因的表达，包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。 操纵子的组成： -结构基因(structural gene, SG) ：操纵元中被调控的编码蛋白质的基因 -启动子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 -操纵基因(operator，O)：是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列。阻遏物基因(inhibitor,I),产生阻遏物(repressor)。乳糖操纵子的结构和功能 三个特异性序列：三个特异性序列： 操纵序列操纵序列 O (op

7、erator): 阻遏蛋白结合位点。阻遏蛋白结合位点。 启动子启动子 P (promoter): 位于结构基因的上游。位于结构基因的上游。 CAP结合位点：环结合位点：环cAMP受体蛋白受体蛋白(分解代谢物激活蛋白分解代谢物激活蛋白)结合位点。结合位点。 一个调节基因一个调节基因llac I：编码阻遏蛋白，能结合于操纵序列位点。：编码阻遏蛋白，能结合于操纵序列位点。乳糖操纵子的结构和功能结构基因结构基因 Z编码编码-半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。 Y编码编码-半乳糖苷透过酶：半乳糖苷透过酶：使外界的使外界的-半乳糖苷（如乳糖）半乳糖苷（如乳糖）

8、能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 A编码编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶乙酰辅酶A上的乙酰基转上的乙酰基转到到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。乳糖操纵子的结构和功能 当一个mRNA含有编码一个以上蛋白质的编码信息，而且这些蛋白质都是以独立的多肽被翻译时，这样的mRNA称之多顺反子mRNA。 多顺反子mRNA在细菌中是很普遍的。 多顺反子lac mRNA中的lacZ，lacY，lacA经翻译生成的产物分别生成代谢分解乳糖的三种酶 始终存在着一定的比例关系( Z : Y : A = 5 : 2

9、: 1 )乳糖操纵子的结构和功能乳糖操纵子的结构和功能 lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白R所控制。lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。 由于lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因的附近。它是能够分散到各处或结合到分散的DNA位点上。乳糖操纵子的结构和功能阻遏蛋白的阻遏蛋白的负负调控调控 (negative control of repressor)阻遏蛋白的阻遏蛋白的负负调节调节(negative control of repressor) 无乳糖无乳糖(no lactose):(no lactose)

10、: laclac操纵元处于阻操纵元处于阻遏状态遏状态(repression)(repression) 有乳糖有乳糖(presence of lactose)(presence of lactose)：laclac操操纵元即可被诱导纵元即可被诱导(derepression,induction)(derepression,induction) 诱导剂诱导剂(inducer):(inducer): 别乳糖、半乳糖、别乳糖、半乳糖、IPTGIPTG（异丙基硫代半乳糖苷）（异丙基硫代半乳糖苷）The Lac Operon:When Glucose Is Present But Not LactoseRe

11、pressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRNAPol.RepressorRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCome on, let me throughNo way!CAPCAPThe Lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveLacRepre

12、ssorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeYeah!RNAPol.RNAPol. 乳糖操纵子的调控机理乳糖操纵子的调控机理乳糖操纵子诱导物别乳糖别乳糖(allolactose)是诱导物是诱导物为什么选用IPTG作诱导物？ 能诱导酶的合成，但又不被分解的分子,称为安慰诱导物（gratuitous inducer）。 由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。 X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-半乳糖苷）也是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此

13、可以用作 半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。 为什么选用IPTG作诱导物？ 某些诱导物与自然的-半乳糖苷酶相似，且不能被酶分解，比如异丙基-D-硫代半乳糖苷，（isopropylthiogalactoside,IPTG）。不被细菌分不被细菌分解性质稳定，解性质稳定，它的浓度在实验中不会改变。 复杂的动力学问题，便于研究。 IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送。为什么选用IPTG作诱导物？乳糖（葡萄糖-1，4-D-半乳糖苷） 半乳糖苷键中用半乳糖苷键中用硫硫代替了代替了氧氧，失去了水解活性，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同源的氧代化

14、合物与酶位点但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，的亲和力相同，IPTG虽不为虽不为-半乳糖苷酶所识半乳糖苷酶所识别，但它是别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。基因簇十分有效的诱导物。乳糖操纵子的乳糖操纵子的CAP正调控正调控（Positive Control of CAPPositive Control of CAP） CAP(catabolite activator protein)(catabolite activator protein) - -分解代谢基因激活蛋白分解代谢基因激活蛋白 又称为又称为 CRP (cAMP receptor protein), (cAM

15、P receptor protein), laclac operon operon高水平转录高水平转录必需必需的一个的一个激活蛋白激活蛋白。 CAP( (同二聚体同二聚体),),含含 DNA结合区结合区 以二聚体的方式与特定的以二聚体的方式与特定的DNADNA序列结合序列结合 cAMP结合区结合区与与cAMPcAMP特异结合，并发生空特异结合，并发生空间构象的变化间构象的变化, ,形成形成cAMP-CAPcAMP-CAP复合物（有活性复合物（有活性）乳糖操纵子的乳糖操纵子的CAP正调控正调控（Positive Control of CAPPositive Control of CAP） 当当C

16、AP与与CAP结合位点这段序列结合时，结合位点这段序列结合时，可激活可激活RNA转录酶活性，使之提高转录酶活性，使之提高50X 葡萄糖葡萄糖 降解产物降解产物 ATP cAMP 5AMPCRP（非活性状态）（非活性状态） CAP（活性状态）（活性状态）乳糖操纵子的乳糖操纵子的CAP正调控正调控（Positive Control of CAPPositive Control of CAP）+ + + + + + + + 转录转录无葡萄糖，无葡萄糖，cAMP浓度高时浓度高时促进转录促进转录有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP浓度低时浓度低时不促进转录不促进转录CAPZYAOPDNACAPCAPCAPCAP

17、CAP乳糖操纵子的乳糖操纵子的CAP正调控正调控（Positive Control of CAPPositive Control of CAP） 葡萄糖效应：当细菌在含有葡萄糖套和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖。只有当葡萄糖消耗完，经过一段停滞期，在乳糖的诱导下半乳糖苷酶开始合成，细菌才能充分利用乳糖。 葡萄糖的降解物能抑制腺苷酸环化酶活性，并活化磷酸二脂酶，因而降低 cAMP的浓度。 所以葡萄糖存在时，cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时, cAMP浓度增高，CAP-cAMP 复合物形成（结合于lac operon CAP结合位点)，才会促进转录。乳糖操纵子的乳糖操纵子的协调调控调

18、控 (coordinate regulation) 由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。关键条件：lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和操纵子基因表达受阻遏蛋白和CAP的双重调控的双重调控The Lac Operon:When Lactose Is Present But Not GlucoseRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRep

19、ressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseYeah!RNAPol.RNAPol.The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is PresentRepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingCAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeraseRNAPol.RepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveRepressorSTOPRight therePolymeraseCome on, let me through !Alright, Im off to the races . . .Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和操纵子基因表达受阻遏