高速逆流色谱法

1、高速逆流色谱法高速逆流色谱法高速逆流色谱概述基本原理技术特点工作方法仪器结构方法应用一、概述逆流色谱逆流色谱（countercurrent chromatography, CCC） 是一种简单的液-液分配色谱技术，不用固体支撑体来保留固定相，避免了样品的不可逆吸附、失活和变性等问题，近年来逐步发展成为一种备受关注的新型色谱分离技术。广义定义：1.任何利用两相不混溶液体的色谱技术；2.其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管或一系列的腔体中； 固定相固定相3.同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。 流动相流动相减少了溶质分子与固体支撑体之间各种复杂的相互作用；不仅可以获得高纯度的分离

2、组分；同时具有较高的回收率和重现性。逆流色谱的发展20世纪50年代，逆流分溶法逆流分溶法（CCD）被广泛用于天然产物的分离。有设备庞大复杂、溶剂消耗大、分离时间太长等缺陷。20世纪70年代，液滴逆流色谱液滴逆流色谱（DCCC）利用重力场将固定相保留在管形柱中，使流动相以液滴形式通过固定相。缺陷是分离时间长，溶剂体系有限。改进后的离心分配色谱离心分配色谱和螺旋管式逆流色谱螺旋管式逆流色谱，利用离心力场来实现固定相的保留，缩短了分离时间。20世纪70-80年代，高速逆流色谱高速逆流色谱(high-speed CCC, HSCCC)被研制。利用螺旋管的特殊同步行星式运动模式，短时间内实现高效分离。1

3、993-1994年间，pH-pH-区带精制逆流色谱技术区带精制逆流色谱技术发展起来，成功用于有机酸和有机碱的分离。1998年，Ito研究得到离心沉淀色谱离心沉淀色谱，为生物大分子以及细胞等生物物质分离开辟渠道。2002年，螺线形圆盘柱式高速逆流色谱螺线形圆盘柱式高速逆流色谱，改善保留。高速逆流色谱（高速逆流色谱（HSCCCHSCCC）High-speed countercurrent chromatography建立在一种特殊的流体动力学平衡基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生的不对称离心力场，实现两相溶剂体系的充分保留和有效混合及分配，从而实现物质在两相溶剂中高效分离。二、基本原理现代逆流

4、色谱仪器体系：1.1.流体静力学平衡体系流体静力学平衡体系2.2.流体动力学平衡体系（流体动力学平衡体系（HSCCCHSCCC体系）体系）仪器的两个特征特征：a 有一个或多个缠绕有多层聚四氟乙烯管的线轴；b 没有旋转密封接头，有一个安装有两个旋转轴的齿轮传动装置，能产生一个可变的离心力场。 通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场，保留两相中的其中一相作为固定相；离心力场的强度和方向都可以变化；倾析和混合交替出现，两相液体在螺旋管柱中总是处在接触状态，没有死体积存在；流体动力学CCC中压力小，固定相保留值大。高速逆流色谱法是建立在单向性流体动力平衡体系单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流

5、色谱分离方法，它是在研究旋转管的流体动力平衡时偶然发现的。当螺旋管在高速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到另一端。用某一相作移动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管里的保留值大约50%，但这一保留量会随着移动相流速的增大而减小，使分离效率降低。但使螺旋管的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中一相全部占据首端的一段，称这一相为首端相，另一段全部占据尾端的一段，称为尾端相。高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征，在高的螺旋管转动速高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送入尾相，它将穿过首

6、端相而移向螺旋管的尾端。分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相(固定相)，然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多，分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速逆流色谱。 三、技术特点不用固体支撑体，避免了物质的不可逆吸附、失活和变性等；滞留柱中的样品可通过多种洗脱方式予以完全回收有广泛的两相溶剂体系可供选择，大大增加其适用范围；粗样可以直接上样而不会对柱子造成任何损害；操作成本低，制备量大；操作灵活，固定相和流动相之间可以互换作用；柱子可用合适溶剂清洗后重复使用。高速逆流色谱与高效液相色谱比较HPLC和HSCCC的固定相体积不同 理论塔板数

7、的工作范围不同；到目前为止，逆流色谱的最高分离效率低于5000理论塔板数。HSCCC中溶质可以进入并接触到液态固定相的整个体积；HPLC中，溶质不能进入到固体支撑体内部，仅涂渍在表面的有机层的液-固界面 HPLC有过载现象；HSCCC进样体积可达到柱体积的20%，广泛用于制备性分离。 HSCCC HSCCC与与HPLCHPLC是互补的分离技术是互补的分离技术参数参数HSCCCHSCCCHPLCHPLC固定相液体固体机理液-液分配（简单）分配、吸附、离子交换、体积排阻等（复杂）溶质与固定相作用与液体固定相的整个体积相接触在固定相与固体支撑体的界面相互作用上样量高中等分离效率低高操作容易复杂费用便

8、宜昂贵危险性高速运转产生机械故障安全四、工作方法HSCCC的分离效果与以下因素有关：1.1.所选择的溶剂体系所选择的溶剂体系2.2.固定相和流动相的选择固定相和流动相的选择3.3.洗脱方式洗脱方式4.4.仪器的转向和转速仪器的转向和转速5.5.样品浓度样品浓度6.6.进样方式进样方式7.7.柱温等柱温等1、溶剂体系的准备满足以下要求满足以下要求：p不造成样品的分解与变性；p足够高的样品溶解度；p样品在系统中有合适的分配系数值；p固定相能实现足够高的保留。溶剂体系须给予足够时间使两相达到充分的平衡。溶剂体系须给予足够时间使两相达到充分的平衡。需要对混合溶剂进行脱气。需要对混合溶剂进行脱气。几种常

9、用的溶剂体系选择方法参比已知的溶剂体系：文献被分离物质种类被分离物质种类基本两相溶剂体系基本两相溶剂体系辅助溶剂辅助溶剂非极性或弱极性物质正庚（己）烷-甲醇氯烷烃正庚（己）烷-乙腈氯烷烃正庚（己）烷-甲醇（或乙腈）-水中等极性物质氯仿-水甲醇，正丙醇，异丙醇乙酸乙酯-水正己烷，甲醇，正丁醇极性物质正丁醇-水甲醇，乙酸几种常用的溶剂体系选择方法分配系数测定法（K:0.5-2，用分析型HPLC确定）HPLC扫描法（15cm长C18柱，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，观察出峰位置）薄层色谱法生物活性物质分配比率法：只适用于生物活性成分分析型HSCCC法：用来选择制备型分离时所用的溶剂体系2、柱系统的准备

10、固定相注入螺旋管柱内1.重相为固定相：尾头2.轻相为固定相：头尾仪器以选定转速转动流动相以合适流速泵入柱内检测器基线稳定时，柱系统准备就绪进样分析3、样品溶液的准备和进样通常将样品混合物溶解在分离所用的溶剂体系中样品量较小时：可将样品溶解流动相中样品量较大时：建议将样品溶解在相同体积的上相和下相溶剂的混合液中。（物理性质发生变化，样品进入分离柱后，会导致固定相的严重流失）不能进太高浓度的样品允许相当量的不溶性物质进入色谱柱4、洗脱方式梯度洗脱梯度洗脱（1 1）三元的溶剂体系）三元的溶剂体系 选择溶剂1和溶剂2为两种互溶溶剂（梯度溶剂）， 溶剂3不与前面任何一种互溶。 庚烷-甲醇-水体系：庚烷（

11、固定相）水相（流动相） 乙酸乙酯-正丁醇-水体系：水（固定相）乙酸乙酯（流动相） 用于糖苷混合物的分离 糖苷溶解度：正丁醇 水 乙酸乙酯（2 2）多元溶剂体系：）多元溶剂体系：情况复杂 正庚（己）烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系 上相：正庚（己）烷-乙酸乙酯有机相 下相：水-甲醇 甲醇变化 上相溶解在水相中 梯度溶剂一般总是使固定相体积减少。（3 3）线性梯度和步进梯度）线性梯度和步进梯度 双向洗脱双向洗脱 样品组分覆盖极性范围宽，采用等比例或梯度洗脱都很难实现一次性分离。p第一步：反向洗脱极性的水相-流动相非极性的有机相-固定相p第二步：正向洗脱有机相-流动相 从相反方向泵入柱中虽然双向洗脱得到的

12、选择性并不十分令人满意，但是具有：被分离物质的全部回收、无不可逆吸附 以及有可能分离极性范围非常宽的样品组分，柱子可以重复使用而不需补充任何溶剂等优点。清空柱子清空柱子 利用逆流色谱的液态固定相的特性，即将保留在柱中对固定相有极强亲和力，也就是分配系数高的成分，用多余的液体推出柱外以达到回收的目的。5、检测紫外-可见光检测器1.单波长、多波长UV-VIS2.制备型HPLC的检测器（检测池：直形的垂直流通型的。因为分析型HPLC的U形检测池容易使固定相液滴滞留在池中，引起检测器噪声。）避免措施：轻相流动相从检测池上端进入，向下流出； 重相流动相从检测池下端进入，向上流出。蒸发光散射检测器傅里叶红

13、外光谱检测器 （HSCCC获得高的溶质-溶剂比的流出物，使流动相吸收红外光谱的问题得到解决。）薄层色谱检测器（样品喷雾装置）质谱检测器五、仪器结构分析型制备型方法应用分析型分析型HSCCCHSCCC的应用的应用1.1.溶剂体系的快速筛选溶剂体系的快速筛选利用分析型HSCCC体积小、速度快、溶剂消耗小的特点。例：Pharma-tech的CCC-20分析型逆流色谱仪（柱体积43mL） Ito制备型多层螺旋管分离仪（柱体积280mL） 沙棘黄酮的分离分析型HSCCC上样量3mg，分离过程15min；制备型HSCCC上样量100mg，分离过程2.5hr。葛根异黄酮的分离2.2.分配系数的测定分配系数的

14、测定 在CCC中，由于溶质的分配系数可以从色谱图中计算而得，因此可以作为一种新型的测定分配系数的方法。例：系列烷基苯在正庚烷-甲醇-水体系中的分配系数3.3.小量天然产物样品的分离小量天然产物样品的分离 粗样或其它复杂样品可以直接进样而不需要预先处理，样品也不会因为不可逆吸附而损失。例：多酚类物质的分离。 这类物质在HPLC上容易与色谱柱上的固体填料之间产生相互作用，而导致拖尾。在硅胶柱上易发生不可逆吸附。 HSCCC被认为是分离多酚类物质最有效的手段。例：植物粗提物的分离纯化。 很好的样品富集和预处理的手段。 分析型HSCCC作为一种为制备型HSCCC进行方法开发和小量样品的分离纯化手段，会

15、有较好的应用前景。4.4.中药指纹图谱研究方面的应用中药指纹图谱研究方面的应用 在不可能将中药复杂成分都搞清楚的情况下，指纹图谱的作用是反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。 HSCCC相对于其他色谱技术具有许多独特有点。应用领域与拓展双水相逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用离心沉淀色谱在蛋白质等分离中的应用逆流色谱在手性分离中的应用逆流色谱在天然药物工业中的应用双水相逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用双水相逆流色谱在蛋白质分离纯化中的应用双水相体系（aqueous two-phase system, ATPS）是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相

16、溶的两水相或多水相系统。通过溶质在两相间分配系数的差异而进行分离的方法称为双水相萃取技术。最常见：聚乙二醇（PEG）-磷酸盐水溶液体系 聚乙二醇（PEG）-葡聚糖（DEX）体系成功用于蛋白质的大规模分离中。离心沉淀色谱在蛋白质等分离中的应用离心沉淀色谱在蛋白质等分离中的应用色谱分离是依据被分离物在两相中分配系数的不同而进行；逆流色谱是利用物质在两相液体中分配系数的不同实现分离；分离也可以依据被分离物在一个含有沉淀剂的浓度梯度变化的单一溶剂中的溶解度的不同而实现。 （前提：沉淀剂浓度梯度移动的速度远低于溶剂流速）溶解度具有很小差异的物质，经过在柱中反复的沉淀和溶解即可达到分离。离心沉淀色谱离心沉

17、淀色谱（centrifugal precipitation chromatography, CPC）是一种建立在类似于逆流色谱的不用固体支撑体的开放性通道基础上的沉淀和溶解色谱。具有一定浓度梯度的沉淀剂通过半透膜引入柱中，沉淀的样品分子通过离心力保留在柱中。克服了传统色谱中由固体支撑体引起的样品损失及柱子堵塞等问题。应用于蛋白质和一些合成高聚物的分离。原理：由一层半透膜隔开的一对通道构成的分离柱系统。上层：高浓度沉淀剂硫酸铵溶液下层：水 形成沉淀剂浓度梯度将一个混合样品引入到下层通道，所有组分根据溶解度不同逐步沉淀下来；降低上层沉淀剂浓度开始分离洗脱。蛋白质分离条件的优化 逆流色谱在手性分离中

18、的应用逆流色谱在手性分离中的应用逆流色谱的优势1.独特的高制备能力、低廉的液态固定相和低溶剂消耗；2.不需要采用化学手段将手性试剂键合到固体介质上，只需将其添加到液态固定相中即可；3.同一根逆流色谱分离柱可以反复多次用于不同手性化合物的分离，只需选择合适的两相溶剂体系和手性试剂；4.通过调节加入到液态固定相中手性试剂的量，同一根逆流色谱柱既可用于手性分析，也可用于手性制备性分离。仪器体系和操作步骤常用手性试剂N-十二烷酰基-L-脯氨酸-3,5-二甲基酰基苯胺（DPA）磺化-环糊精（CD） CD是由6、7或8个吡喃糖（含手性碳原子）构成的环状化合物，具有亲脂性的内腔和亲水性的周沿。当对映体的分子大小及憎水性与腔体相匹配，且和