猪细菌、病毒病检疫

1、细菌/病毒性猪病鉴定主要猪病检测项目n猪瘟n非洲猪瘟n口蹄疫n高致病性蓝耳病n伪狂犬n传染性胃肠炎n传染性胸膜肺炎n流行性腹泻一、猪瘟n猪瘟（Swine Fever SF）是猪的一种高度接触性传染病,在欧洲称为古典猪瘟（Classical Swine Fever ,CSF）。猪瘟病毒（Classical swine fever virus ,CSFV）是黄病毒科（Flaviviridae）的瘟病毒属（Pestivirus）的一个成员。瘟病毒是具有囊膜的正链小RNA病毒。这个属的成员还有在抗原性和结构密切相关的牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）和

2、羊边界病毒（Border disease virus，BDV）。CSFV与BVDV之间的基因组具有高度同源性，抗原关系密切，有血清学交叉反应。 n主要检测方法：病毒分离与鉴定、免疫过氧化物酶结合试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验（ELISA）、血清中和试验（SN）、荧光定量RT-PCR检测（SYBR-Green I）n国际标准：OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册n国内标准GB/T16551-2008猪瘟诊断技术、GB/T27540-2011猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法、SN/T1379-2010古典猪瘟检疫规程n对于活猪，进行全血病毒和血清中抗体的检测是C

3、SFV诊断的必选方法。因此，检测病死猪器官样品中的病毒或抗原是最适宜的诊断方法。由于经常在种猪中监测到抗反刍兽瘟病毒病原抗体，因此筛选试验后必须进行确诊，选用适当的方法鉴别BVD、边界病病毒和CSFV抗体的试验极为重要。过氧化物酶标中和试验（NPLA），荧光抗体病毒中和试验（FAVN）和酶联免疫吸附试验（ELISA）适合。三种试验敏感性和特异性较高，NPLA和ELISA结果可用肉眼观察，也能通过仪器自动测定。n根据不同的检测方法，采集不同的样品： 荧光抗体试验：采集扁桃体、脾、肾和回肠远端，并在无防腐剂的冷藏条件下运送，样品不能冻结。 病毒分离和分子生物学检测：扁桃体为首选器官，也可采集全血（

4、抗凝）、血清、淋巴结和脾。 抗体检测：采集感染猪血清，样品应保持低温运输。检测技术概述试剂盒名称国家及其公司HerdChek CSFV抗体检测试剂盒美国IDEXX公司阻断ELISA，检测猪血清及血浆中的CSFV抗体HerdChek CSFV抗原检测试剂盒美国IDEXX公司抗原捕获ELISA，用来检测猪外周血白细胞、全血、细胞培养物、和组织培养物中的特异性CSFV抗原CHEKIT 猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒美国IDEXX公司间接ELISA，针对E2糖蛋白，适用于区分猪瘟病毒感染与牛病毒性腹泻病毒和边界病病毒猪群。CHEKIT 猪瘟病毒抗原检测试剂盒美国IDEXX公司抗原捕获ELISA，该试剂盒与

5、抗体检测试剂盒联合使用可在感染后前两周检测到病毒。CHEKIT 猪瘟病毒标记检测试剂盒美国IDEXX公司官方允许使用于欧盟成员国，用来区分E2亚单位疫苗（Erns抗体阴性）接种猪于猪瘟病毒感染猪（Erns抗体阳性）CeditestCSFV抗体检测试剂盒荷兰Prionics Lelystad公司竞争ELISA（针对E2蛋白）CeditestCSFV2.0抗体检测试剂盒荷兰Prionics Lelystad公司阻断ELISACeditestCSFV2.0抗原检测试剂盒荷兰Prionics Lelystad公司双抗体夹心ELISACeditestCSFV2.0抗体Erns检测试剂盒荷兰Prionic

6、s Lelystad公司阻断ELISACIVTEST SUIS HC/PPC西班牙海博莱生物大药房竞争ELISA部分商品化CSFV检测ELISA试剂盒 二、非洲猪瘟n非洲猪瘟（african swine fever，ASF）是猪的一种DNA病毒病，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属中的唯一成员。其特征是死亡率高，皮肤有变红的区域和内脏器官严重出血。其病型可分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型和隐性型。临诊症状和古典型猪瘟十分相似。n1国际标准 OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册（2008）第2.1.12章非洲猪瘟规定了国际贸易中推荐使用的检测技术，包括病毒分离与鉴定、PCR、ELISA等。n2国内

7、标准 国家标准：非洲猪瘟诊断技术GB/T 18648-2002 行业标准：非洲猪瘟检疫技术规范SN/T 1559-2010n3部分商品化试剂盒 现阶段主要有西班牙的非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒。n非洲猪瘟与猪瘟的其他出血性疾病的症状和病变都很相似，他们的亚急性型和慢性型在生产现场实际上是不能区别的，因而必须用实验室方法才能鉴别。n实验室诊断方法包括病毒分离、病毒抗原和基因组DNA的检测及抗体的检测。具体的实验室诊断方法有补体结合（CF）试验、琼脂扩散试验（AGID）、红细胞吸附（HAD）试验、对流免疫电泳（CIEP）、反向辐射免疫扩散试验、直接荧光抗体试验（FAT）、间接荧光抗体（IFA）

8、试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹试验、聚合酶链反应（PCR/Real-time PCR）。nPCR可有效地用于检测血液或组织中的的病毒基因组，这项技术尤其适用于样品因腐败不适于做病毒分离和抗原检查时。在ASF呈地方性流行的地方，确诊最好用ELISA，结合另一种血清学试验方法如IFA或抗原检测方法如FAT。n目前发展起来实时荧光定量PCR检测技术,在2002年Scott M. Reidb, Geoffrey H.等以VP72为靶基因，建立了实时荧光定量PCR检测技术。检测技术概述n样品的采集和处理 病毒分离与分子生物检测：采集抗凝血液、组织液及脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结等病变脏器。

9、 血清学检测：采集猪血清。检测技术概述三、口蹄疫n口蹄疫（foot-and-month disease，FMD）是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病 。该病有7个血清型，分别是O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和亚1型。动物感染一种血清型病毒后不对其他型病毒具有免疫力。在临床上，FMD不能与其他水泡性疾病，包括猪水泡病、水泡性疹和水泡性口炎项区别，因此需进行实验室诊断。牛、羊、猪等偶蹄动物都易感染口蹄疫 。国内主要感染为A型、O型、亚1型。n1国际标准nOIE陆生动物诊断试验和疫苗手册（2012）第2.1.5章口蹄疫规定了国际贸易中推荐使用的检测技术，包括补体结

10、合试验、病毒中和试验、固相竞争ELISA、液相阻断ELISA等。n2国内标准n国家标准，口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法（GB/T 27528-2011）、口蹄疫诊断技术（GB/T 18935-2003 ），口蹄疫检疫技术规范（SN/T 1181-2010），规定了荧光RT-PCR、微量补体结合试验、食道探杯查毒试验、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、病毒中和试验、液相阻断ELISA、病毒感染相关抗原（VIA）琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）七种诊断技术为我国出入境和国内动物口蹄疫的诊断方法，以及固相竞争酶联免疫吸附试验。n20世纪40年代以来，口蹄疫诊断技术有了较大的发展，从最早的

11、病毒分离和补体结合试验到包括病毒中和试验在内的其它血清学方法，以及现在推广应用的ELISA和PCR技术，逐渐向更敏感、特异、方便、快速的方向发展，可以用非结构蛋白抗体鉴别感染和免疫动物的检测方法研究。尽管如此，经典的病毒分离、补体结合试验和病毒中和试验依然是最可靠准确的方法。 检测技术概述四、高致病性蓝耳病n猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）（俗称猪蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种猪的高度接触性传染病 。PRRSV在分类上属动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arteriv

12、irus），是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。中国主要流行株为美洲型毒株。 n1国际标准 OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册（2008）第2.8.7章猪繁殖与呼吸综合征规定了国际贸易中推荐使用的检测技术，包括病毒分离与鉴定、IPMA、IFA、ELISA等。n2国内标准 猪繁殖与呼吸综合征诊断方法（GB/T 18090-2008），规定了临床诊断、病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验 （IPMA）、间接免疫荧光试验 （IFA）、间接酶联免疫吸附试验 （间接ELISA） 和反转录-聚合酶链反应试验 （RT-PCR）六种诊断技术为我国出入境和国内生猪PRRS的诊断方法。 猪繁殖和呼吸综合征检疫规范

13、（SN/T 1247-2007），对病毒分离和鉴定、IPMA、ELISA和血清中和试验（SN）做出了规范。n病原学鉴定n因分离病毒所选用猪肺泡巨噬细胞较难获得，所以导致病毒分离较为困难。已有用免疫组化和免疫荧光方法检测组织样品中PRRS抗原的报道，这两种检测方法比用病毒分离更快捷且无须细胞培养设备，且可以对经福尔马林固定的病变组织进行病毒鉴定，并对病毒进行追溯性分析。用原位杂交法检测和区别北美株和欧洲株基因型也有报道。RT-PCR及套式PCR方法广泛用于病原检测。最近有用限制性片段长度多态性分析的方法可用于野毒株和疫苗株的区分。n血清学试验n一般采用联合试验，如IPMA 、IF、ELISA方法

14、。n2样品的采集和处理n根据不同的检测方法，采集不同的样品。n病毒分离和分子检测：采集全血（抗凝）、血清、肺脏、呼吸道组织、淋巴结、脾和扁桃体。其中，血清和肺灌洗液最适合病毒分离；流产仔猪、木乃伊仔猪不适于分离病毒，但可用作RT-PCR检测。n抗体检测：采集感染猪血清，样品应保持低温运输。检测技术概述试剂盒名称ELISA形式检测范围国家及其公司HerdChekPRRS间接ELISA（N蛋白）通用型抗体美国IDEXX公司HerdChek PRRSX3间接ELISA通用型抗体美国IDEXX公司LSIVET SUIS PRRS A/S间接ELISA（GP蛋白）美洲型抗体法国LSI公司LSIVET S

15、UIS PRRS E/S间接ELISA（GP蛋白）欧洲型抗体法国LSI公司INGEZIMPRRS UNIVERSAL间接ELISA（N蛋白）通用型抗体西班牙Ingensa公司BioChek PRRS间接ELISA（N蛋白）通用型抗体荷兰BioChek公司GreenSpring TM PRRS Antibody Elisa Test Kit间接ELISA（N蛋白）通用型抗体马来西亚GreenSpring公司部分商品化PRRS抗体检测ELISA试剂盒 五、伪狂犬n伪狂犬病也称为奥耶兹基氏病是由a疱疹病毒引起的传染病，该病主要与猪有关，猪是其自然宿主，病猪康复后仍呈隐性感染。n病原鉴定：分离病毒可以

16、将采集的脑、扁桃体或采自鼻喉的样品匀浆后接种易感细胞系，如猪肾细胞（PK-15）或SK6细胞、原代或传代细胞系加以增殖，通过免疫荧光、免疫过氧化物酶或特异性抗血清中和试验检测特征性细胞病变加以鉴定，另外，还可以用PCR方法鉴定。n血清学试验：可用病毒中和试验、胶乳凝集试验或酶联免疫吸附检测伪狂犬病抗体。OIE推荐的一种国际标准血清规定了敏感性的下限，用于本病血清学实验室常规检测。n1国际标准 OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册（2008）第2.2.2章伪狂犬病（奥耶兹基氏病）规定了国际贸易中推荐使用的检测技术，包括病毒分离与鉴定、PCR、中和试验、ELISA等。n2国内标准 国家标准， 伪狂犬病

17、诊断技术（GB/T 18641-2002 ），67行业标准，伪狂犬病检疫技术规范（SN/T 1698-2010 ），猪伪狂犬病免疫酶试验方法（NY/T678-2003）分别对病毒分离和鉴定、聚合酶链式反应、家兔接种试验适用于伪狂犬病毒的检测；中和试验、ELISA适用于非免疫动物伪狂犬病抗体的检测以及免疫后抗体水平的检测；胶乳凝集试验适用于实验室和现场对伪狂犬病抗体的早期检测。检测技术概述试剂盒名称ELISA形式检测范围国家及其公司猪伪狂犬病毒gI抗体诊断试剂盒阻断ELISA通用型抗体IDEXX公司猪伪狂犬病毒gE抗体诊断试剂盒阻断ELISA通用型抗体svanova公司猪伪狂犬病毒gB抗体诊断试

18、剂盒间接ELISA通用型抗体svanova公司猪伪狂犬病病毒（全）抗体检测试剂盒间接ELISA美洲型抗体西班牙Ingensa公司猪伪狂犬病毒gB抗体诊断试剂盒间接ELISA通用型抗体西班牙Ingensa公司猪伪狂犬病毒gE抗体诊断试剂盒间接ELISA通用型抗体西班牙Ingensa公司部分商品化伪狂犬病毒抗体检测ELISA试剂盒 六、猪传染性胃肠炎n猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒引起的猪的一种肠道疾病。在很多地区流行一种呼吸道变异株（猪呼吸道冠状病毒PRCV），这种病毒很可能是TGEV的缺失变异毒株。PRCV看来不是一种重要的原发病原体，但是它导致TGE的诊断，特别是血清学诊断变

19、得复杂化。n病原鉴定：可通过组织培养法分离病毒、电镜观察和各种免疫诊断方法以及近来经常采用的病毒特异性RNA检测来鉴定。而应用最为广泛的快速鉴定方法可能是免疫学诊断方法，特别是对粪便进行酶联免疫吸附试验和小肠冰冻切片的荧光抗体试验。病原也可以用间接血凝试验来检测。另一种猪的肠道病毒性疾病，猪流行性腹泻（PED），是由一种血清学不同的冠状病毒引起的，这种病毒在电子显微镜下的形态与TGEV相同，但是免疫电镜可以将其区分开。n应用最广泛的血清学中和试验和ELISA，只有后者才能把TGEV和PRCV区别开来，因为两者的抗体存在完全的中和交叉反应。另外，间接血凝试验和血凝抑制试验也可用于TGE的血清学诊

20、断。n1国际标准 OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册（2008）第2.6.4章猪传染性胃肠炎规定了国际贸易中推荐使用的检测技术，包括病毒分离与鉴定、中和试验、IFA、ELISA等。n2国内标准 行业标准，猪传染性胃肠炎检疫规范（SN/T 1446-2010 ），猪传染性胃肠炎诊断技术（NY/T548-2002）对病毒分离和鉴定、直接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR法和微量血清中和试验（SN）做出了规范。n病原检测样品采集粪便、小肠及内容物n抗体检测：采集感染猪血清，样品应保持低温运输检测技术概述试剂盒名称ELISA形式检测范围国家及其公司TGEV/PRCV-Ab区分检测试剂盒阻断ELISA通

21、用型抗体svanova公司猪传染性胃肠炎和冠状病毒二联抗体检测试剂盒间接ELISA通用型抗体西班牙Ingensa公司猪传染性胃肠炎ELISA抗体检测试剂盒间接ELISA通用型抗体西班牙Ingensa公司部分商品化传染性胃肠炎病毒抗体检测ELISA试剂盒 七、猪传染性胸膜肺炎n猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。菌体有荚膜，不运动，革兰氏阴性，为兼性厌氧菌。本菌包括两个生物型，生物型为 NAD依赖型，生物型为NAD非依赖型。生物型菌株毒力强，危害大。生物型可引起慢性坏死性胸膜肺炎。根据细菌荚膜多糖和细菌脂多糖对血清的反应，生物型分为14个血清型，我国流行的主要以血清7型为主，其次为血清2、4、5、10型。n病原的分离鉴定 将无菌采集的病料接种在7%马血巧克力琼脂、划有表皮葡萄球菌十字线的5%绵羊血琼脂平板或加人生长因子和灭活马血清的牛心浸汁琼脂平板上，于37含5%10%CO2条件下培养。如分离到的可疑细菌，可进行生化特性、CAMP试验、溶血性测定以及血清定型等检查。n血清学诊断 包括补体结合试验、2-巯基乙醇试管凝集试验、胶乳凝集试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等方法。国际上公认的方法是改良补体结合试验，该方法可于感染后1