第三章植物细胞培养2014-9

1、植物细胞培养植物细胞培养1. 植物单细胞培养2. 植物细胞悬浮培养3. 植物细胞大规模培养及次生物质生产4. 原生质体培养植物细胞培养植物细胞培养(plant cell culture)指在离体条件下，将分离得到的游离的指在离体条件下，将分离得到的游离的单个细单个细胞或小细胞团胞或小细胞团，通过继代培养使，通过继代培养使细胞增殖细胞增殖，从而，从而获得大量细胞群体的一种技术。获得大量细胞群体的一种技术。目的目的：获得的细胞群体可以作获得的细胞群体可以作为为制备有价值代谢产物制备有价值代谢产物的原料，的原料，也可以作为也可以作为细胞改良细胞改良的材料。的材料。同时也是人工种子，原生质体同时也是人

2、工种子，原生质体培养，花药培养等的支撑技术培养，花药培养等的支撑技术C1.单细胞的分离与培养单细胞的分离与培养一、一、分离单细胞的方法分离单细胞的方法 1、物理方法 2、酶法 3、化学方法 机械法：机械法：主要通过机械磨碎、切割植物体从而获主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单体。如叶肉组织细胞的分离。得游离的单体。如叶肉组织细胞的分离。撕去下表皮撕去下表皮露出叶肉细胞露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞用解剖刀刮下细胞 愈伤组织细胞愈伤组织细胞之间的结构非常松散，因此可以通之间的结构非常松散，因此可以通过高频率振动从悬浮状态的愈伤组织中振荡下来过高频率振动从悬浮状态的愈伤组织中振荡下来单个细胞

3、。单个细胞。 酶解法：酶解法：最为有效的一种获得单细胞的方法。根据植物细胞壁的组最为有效的一种获得单细胞的方法。根据植物细胞壁的组成特点选用成特点选用专一性水解酶专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。该法主要用于制备原生质体。解掉，从而释放出细胞。该法主要用于制备原生质体。加果胶酶加果胶酶过滤、离心过滤、离心纤维素酶纤维素酶机械法和酶解法比较机械法和酶解法比较机械法机械法酶解法酶解法1. 细胞不受到酶的伤害；细胞不受到酶的伤害；2. 不用质壁分离；不用质壁分离；3. 细胞产量低；细胞产量低；4. 细胞易破。细胞易破。1. 细胞受到酶的伤害；细胞受到酶

4、的伤害；但易引起细胞生但易引起细胞生理改变理改变2. 要质壁分离；要质壁分离；3. 细胞产量高；细胞产量高；4. 细胞不易破。细胞不易破。 化学方法化学方法 在细胞悬浮培养中加入草酸盐加入草酸盐（能结合细胞间质中果胶钙的钙离子 ）、秋水仙素秋水仙素、 2,4-D2,4-D或水解乳水解乳蛋白蛋白（对细胞分散有一定的作用)。 单细胞培养技术单细胞培养技术平板培养法平板培养法是将悬浮培养的分散细胞均匀分布在一是将悬浮培养的分散细胞均匀分布在一薄层薄层(1mm)(1mm)固体培养基中进行培养的技术。具体步骤：固体培养基中进行培养的技术。具体步骤： 单细胞悬浮液的制备，并记数。单细胞悬浮液的制备，并记数

5、。 调节细胞密度。调节细胞密度。1 11010 -1 -110105 5个个/ml/ml。 30-3530-35混匀浇平板。混匀浇平板。 2525，暗培养暗培养。2-32-3周后计算植板率。周后计算植板率。平板培养的效果一般用平板培养的效果一般用植板率植板率来衡量来衡量植板率植板率：能长出细胞团的单细胞在接种单细能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。胞中所占的比例。植板率()形成的细胞团数接种的细胞数100平板培养注意事项：平板培养注意事项：应选用旺盛分裂期细胞；应选用旺盛分裂期细胞；操作时减少细胞损伤；操作时减少细胞损伤；黑暗或弱光培养。黑暗或弱光培养。植板密度不能低于某一植板密度不

6、能低于某一临界值（临界密度）临界值（临界密度）；110 110 5个个/ml。 临界密度临界密度（最低有效密度）：（最低有效密度）：单细胞培养时，初单细胞培养时，初始植板密度低于某值，培养细胞就不能进行分裂始植板密度低于某值，培养细胞就不能进行分裂和发育成细胞团，则该值就是临界密度和发育成细胞团，则该值就是临界密度; 平板培养中细胞密度和培养基成分是培养成功的平板培养中细胞密度和培养基成分是培养成功的关键，而细胞密度和培养基成分互相依赖（关键，而细胞密度和培养基成分互相依赖（负相负相关）关）; 初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，初始植板密度应根据培养基的营养状况而改变，培养基越复杂则植

7、板细胞的临界密度越低，反之培养基越复杂则植板细胞的临界密度越低，反之则相反。则相反。液体浅层培养 技术：先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。优点：、培养物与空气接触面大，通气性好； 、细胞代谢产物容易扩散，不会造成有害 物质的危害； 、继代培养方便缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察 看护培养看护培养 (nursing culture)(nursing culture)l是指用一块活跃生长的愈伤组是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续织来看护单个细胞，使其持续生长和增殖的一种培养方法。生长和增殖的一种培养

8、方法。这块愈伤组织被称为看护组织。这块愈伤组织被称为看护组织。饲养层细胞和靶细胞没有必要来自同一物种。饲养层细胞和靶细胞没有必要来自同一物种。 饲养层培养（Feeder layer culture）： 把处理过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。 双层滤纸培养双层滤纸培养 Horsch Horsch等（等（19801980）将平板培养与饲养层培养技术相）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法。结合，建立了双层滤纸植板培养方法。培养基饲养层细胞看护滤纸层转移滤纸培养细胞 微室培养微室培养 进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细

9、胞进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。培养技术。 微室培养要求：微室培养要求： 采用光学性能好的材料；材料能使小室与外界隔绝，且能采用光学性能好的材料；材料能使小室与外界隔绝，且能保证适当的气体交换。保证适当的气体交换。 合适的培养基。能保证细胞生长和分裂。合适的培养基。能保证细胞生长和分裂。 选择合适的细胞。处于旺盛分裂期细胞，壁薄，透明度高。选择合适的细胞。处于旺盛分裂期细胞，壁薄，透明度高。优点： 培养基用量少 有利于对细胞特性和单个细胞的生长发育的全过程进行跟踪研究缺点：通气性差，水分难保持，pH易变动。 主要指将主要指将单个游离细胞或小细胞团单个游离细胞或小细胞团在在

10、液体液体培养基进行培养基进行培养增殖的技术。培养增殖的技术。 优点：优点：增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应改善营养供应；在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；振荡培养可以适当改善气体的交换改善气体的交换；(suspension culture) 细胞悬浮培养一般过程细胞悬浮培养一般过程1.1.疏松易碎愈伤组织诱导疏松易碎愈伤组织诱导：易碎的愈伤组织，震易碎的愈伤组织，震荡培养荡培养1-21-2个周；三角瓶和旋转摇床（个周；三角瓶和旋转摇床（80-80-120rpm120rpm）；）；2.2.悬浮细胞的选取：悬浮细胞的选取：筛网过滤；吸取上部悬

11、浮液；筛网过滤；吸取上部悬浮液； 3.3.悬浮细胞的保持：悬浮细胞的保持：继代培养。周期与接种量：继代培养。周期与接种量：1-21-2周，周，1 1：4 41 1：1010。保存好种子细胞系；。保存好种子细胞系；4.4. 以生产代谢产物为目的的细胞悬浮培养以生产代谢产物为目的的细胞悬浮培养，则应，则应采取适当措施分散开不断聚集的细胞团，使细采取适当措施分散开不断聚集的细胞团，使细胞保持继续增殖，胞保持继续增殖，达到最高细胞密度达到最高细胞密度，收获目，收获目的产物。的产物。愈伤组织形成和植株再生愈伤组织形成和植株再生：悬浮细胞可直接形成胚：悬浮细胞可直接形成胚状体或经愈伤组织分化成再生植株（快

12、繁）状体或经愈伤组织分化成再生植株（快繁） 悬浮细胞生长与增殖悬浮细胞生长与增殖 延迟期，对数生长期、直线生长期、减缓期、延迟期，对数生长期、直线生长期、减缓期、静止期、衰亡期。静止期、衰亡期。 影响悬浮细胞生长的因素：影响悬浮细胞生长的因素：1 1、 起始愈伤组织的质量（增殖快、再生能起始愈伤组织的质量（增殖快、再生能力强）力强）2 2、 接种细胞密度接种细胞密度3 3、培养条件：方式、温度、培养条件：方式、温度 悬浮培养细胞的生长及测定悬浮培养细胞的生长及测定最低有效密度或临界起始密度最低有效密度或临界起始密度：细胞的生长周期细胞的生长周期：从开始培养起至细胞增长停：从开始培养起至细胞增长

13、停止的静止期为止。止的静止期为止。有丝分裂指数有丝分裂指数：在一个细胞群体中，处于有丝：在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。分裂的细胞占总细胞的百分数。 悬浮细胞培养的同步化悬浮细胞培养的同步化定义：定义：细胞同时通过细胞周期的某一特定时期。细胞同时通过细胞周期的某一特定时期。计量同步化的方法：计量同步化的方法：某一瞬间处于细胞周期某一特某一瞬间处于细胞周期某一特定点上的细胞所占的百分数；在一定时间内，通过细定点上的细胞所占的百分数；在一定时间内，通过细胞周期某一点（如进入有丝分裂）的细胞百分率；全胞周期某一点（如进入有丝分裂）的细胞百分率；全部细胞通过细胞周期某一点（如有丝

14、分裂后期）所需部细胞通过细胞周期某一点（如有丝分裂后期）所需时间占整个细胞周期时间的百分率。时间占整个细胞周期时间的百分率。1、体积选择法：将培养细胞经过一定大小的体积选择法：将培养细胞经过一定大小的筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集。筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集。 梯度离心法 流式细胞仪2 2、冷处理法：先收集细胞，后在低温（一般、冷处理法：先收集细胞，后在低温（一般为为4 4度）下处理一定时间后加培养液培养。度）下处理一定时间后加培养液培养。（一）物理方法（一）物理方法1、饥饿法饥饿法：控制营养使细胞处于饥饿状态，：控制营养使细胞处于饥饿状态，后加营养培养；后加营养培养；2 2、有丝

15、分裂抑制法有丝分裂抑制法：向培养液中加入化学抑：向培养液中加入化学抑制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、秋水仙素制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、秋水仙素（二）化学方法（二）化学方法 注意：注意：没有普遍实用的细胞同步化方法，没有普遍实用的细胞同步化方法，在实际操作过程中要综合应用各种方法，在实际操作过程中要综合应用各种方法，即使这样，要达到即使这样，要达到高度的细胞同步化也是高度的细胞同步化也是相当困难的。相当困难的。植物细胞的特点植物细胞的特点机械搅拌式反应器鼓泡式反应器气升式反应器植物细胞培养反应器3. 植物细胞培养制备代谢产物植物细胞培养制备代谢产物 初级代谢产物（初级代谢产物（Primary me

16、tabolitesPrimary metabolites） 是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。在不同种类的细胞中，初级代谢产物的种类基本相同。 次级代谢产物（次级代谢产物（Secondary metabolitesSecondary metabolites） 是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点。 工业生产基本步骤工业生产基本步骤建立细胞株建立细胞株：包括材料的选择，愈伤组织和：包括材料的选择，愈伤组

17、织和悬浮细胞的悬浮细胞的诱导，优良细胞系的筛选诱导，优良细胞系的筛选及保存，最适生长条件和产量条及保存，最适生长条件和产量条件的研究。件的研究。扩大培养（种子培养）：扩大培养（种子培养）：将优良的生产用的细胞株经过将优良的生产用的细胞株经过几次扩大繁殖，得到大量的培养细胞，为大规模培养时的几次扩大繁殖，得到大量的培养细胞，为大规模培养时的接种材料。接种材料。大罐培养（发酵）：大罐培养（发酵）：采用成批的，半连续的和连续的培采用成批的，半连续的和连续的培养系统培养细胞。如一步培养法，二步培养法。养系统培养细胞。如一步培养法，二步培养法。提取和纯化产品提取和纯化产品适合工业生产用细胞株的一般筛选流

18、程适合工业生产用细胞株的一般筛选流程 1.愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。 2.单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。 3.细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。 4.细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。 5.性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。 6.细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。培养基的选择培养基的选择 适合细胞生长的培养基不一定适合目的产物适合细胞生

19、长的培养基不一定适合目的产物的生产，因此，采用两步培养法。的生产，因此，采用两步培养法。 (1)(1)维持培养基维持培养基(maintenance media)(maintenance media) 尽可能快的使细胞量增长尽可能快的使细胞量增长(2)(2)生产培养基生产培养基(production media)(production media)诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应代谢产物诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应代谢产物影响次级代谢产物的因素影响次级代谢产物的因素 植物生长物质：植物生长物质：2 2，4-D4-D、NAANAA、IAAIAA、6-BA6-BA、等。、等。 前体：合成代谢物所

20、必需的前体物质。前体：合成代谢物所必需的前体物质。 诱导子：能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径诱导子：能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径发生改变的物质。包括生物（微生物或其提取物等）发生改变的物质。包括生物（微生物或其提取物等）和非生物（辐射、金属离子等）两类。和非生物（辐射、金属离子等）两类。 培养条件培养条件 光：光照时间、光质、光强均有影响。光：光照时间、光质、光强均有影响。 温度：应根据不同细胞培养物及合成不同次温度：应根据不同细胞培养物及合成不同次生代谢物种类而定。生代谢物种类而定。 PHPH：一般在：一般在5-65-6之间。之间。植物细胞培养技术的意义：植物细胞培养技术的意义：

21、1)1)节约能源，减少耕地占用面积，而且不受季节、地节约能源，减少耕地占用面积，而且不受季节、地域限制。有利于对生态环境和珍稀植物资源的保护。域限制。有利于对生态环境和珍稀植物资源的保护。2)2)排除病菌和害虫影响。排除病菌和害虫影响。3)3)可通过特定生物转化途径获得均一的有效成分。可通过特定生物转化途径获得均一的有效成分。4)4)利用植物细胞培养技术生产药物和一些工业原料已利用植物细胞培养技术生产药物和一些工业原料已成为工业化生产植物产品的一条有效途径。通过植成为工业化生产植物产品的一条有效途径。通过植物细胞培养可以生产相当于几倍或几十倍完整植株物细胞培养可以生产相当于几倍或几十倍完整植株

22、所产生的次生物质。具有极大的经济效益。所产生的次生物质。具有极大的经济效益。前提：前提：资源匮乏资源匮乏；引种栽培困难；次生代谢产物的化学；引种栽培困难；次生代谢产物的化学结构清楚，药效肯定；结构清楚，药效肯定；培养技术可行培养技术可行；经济效益高经济效益高。植物细胞培养技术的应用植物细胞培养技术的应用：药物代谢产物药物代谢产物目前采用植物细胞培养生产的药物成分主要包括：目前采用植物细胞培养生产的药物成分主要包括：苷类：皂苷、强心苷、甘草皂苷、香豆精苷等。苷类：皂苷、强心苷、甘草皂苷、香豆精苷等。淄醇：菜油、豆、谷、胆、异岩藻淄醇等。淄醇：菜油、豆、谷、胆、异岩藻淄醇等。生物碱：吡啶、喹啉、异

23、喹啉等。生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。醌类：恩醌、萘醌、返醌等。醌类：恩醌、萘醌、返醌等。蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂、植物病毒蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂、植物病毒抑制剂、植物抗生素等。抑制剂、植物抗生素等。紫杉醇、紫草宁、人参。紫杉醇、紫草宁、人参。 天然食品、食品添加剂天然食品、食品添加剂 色素：色素：胡萝卜素、叶黄素、单宁、黄酮体等。胡萝卜素、叶黄素、单宁、黄酮体等。咖啡咖啡可可碱、咖啡碱；可可碱、咖啡碱；海藻海藻琼脂；琼脂；甜菊叶甜菊叶甜菊苷；甜菊苷；辣椒辣椒辣椒素辣椒素。 杀虫剂、杀菌剂杀虫剂、杀菌剂从万寿菊从万寿菊农药唾吩烷；农药唾吩烷；从鹰嘴豆和扫帚艾从鹰嘴

24、豆和扫帚艾三种鱼藤生物碱、灰叶素、三种鱼藤生物碱、灰叶素、鱼藤酮以及除虫菊脂等；鱼藤酮以及除虫菊脂等；从葫芦巴（香草）从葫芦巴（香草）蓝鱼藤酮、粉红鱼藤酮等杀蓝鱼藤酮、粉红鱼藤酮等杀虫剂；虫剂；从锦葵叶从锦葵叶生物碱。生物碱。 饲料、精细化工等产品饲料、精细化工等产品蚕饲料：桑、蓖麻、榆等。蚕饲料：桑、蓖麻、榆等。银胶菌细胞愈伤组织中生产橡胶。银胶菌细胞愈伤组织中生产橡胶。4.原生质培养 原生质体(protoplast)：脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 。原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast) 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的

25、一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核 胞质体(cytoplast) 不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体 植物原生质体的特点植物原生质体的特点：1 1、吸收能力增强：、吸收能力增强：易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等；易于吸收氧、养分；2 2、具有全能性：、具有全能性：具有全套的遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力； 3 3、在一定条件下可诱导原生质体融合、在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂种细胞 。4 4、分泌能力提高、分泌能力提高 去除了细胞壁的扩散障碍，使细胞膜的透过性增强，利于胞内产物的分泌。5 5、稳定性较差、稳定性较差 失去

26、了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易于受到渗透压等条件变化的影响。a、在基础理论方面 进行细胞壁的再生、细胞膜离子转运、病毒浸染机理研究的最佳试验材料； 分离细胞器和易破坏的大分子方面具有优越性。b、作物改良方面 通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性； 通过体细胞杂交可转移胞质基因； 原生质体是遗传转化的理想受体。植物原生质体的分离和培养v材料选择v原生质体分离的方法v原生质体纯化v原生质体活力测定v影响原生质体数量和活力的因素v原生质体培养方法v影响原生质体培养的因素v原生质体再生过程一一 原生质体的分离原生质体的分离 材料来源 最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均

27、一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。 由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。 植株的年龄和生长条件是十分重要的。 2 2 原生质体的分离方法原生质体的分离方法 机械分离机械分离先质壁分离，然后随机切片。对高度液泡化的细胞有效先质壁分离，然后随机切片。对高度液泡化的细胞有效，受材料限制，费时费力。，受材料限制，费时费力。优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大酶解法酶解法 1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番茄幼苗根尖中大量制备出原生质体； 常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗牛酶等； 优点：条件温和、原生

28、质体完整性好、活力高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的活力。 原生质体分离常用的商品酶原生质体分离常用的商品酶 酶酶 来源来源 生产厂家生产厂家纤维素酶类纤维素酶类onozuka R10 绿色木霉绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, JapanCellulysin 绿色木霉绿色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USADriselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo C

29、o., Tokyo, Japan果胶酶类果胶酶类Macerozyme R-10 根霉根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, JapanPectinase 黑曲霉黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USAPectolyase Y-23 黑曲霉黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan半纤维素酶半纤维素酶Rhozyme HP-150 黑曲酶黑曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USAHemicellulase 黑曲霉黑曲霉 Si

30、gma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA 步骤步骤： 两步法：两步法：解离酶与纤维素酶的使用是解离酶与纤维素酶的使用是一先一后，两步紧紧相连。开始用解离一先一后，两步紧紧相连。开始用解离酶将细胞解离，然后在纤维素酶的作用酶将细胞解离，然后在纤维素酶的作用将细胞转化成原生质体。将细胞转化成原生质体。 一步法：一步法：将植物组织直接放入纤维素将植物组织直接放入纤维素酶和果胶酶的混合酶液中酶解。酶和果胶酶的混合酶液中酶解。图示：原生质体分离过程（以叶片为例）图示：原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心过滤、离心加果胶酶加果胶酶和纤维素酶和纤维素酶 注意事项：

31、注意事项： 酶溶剂及其渗透压酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制，酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制， PH PH。 渗透压调节剂：渗透压调节剂： 有机有机：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 浓度范围浓度范围450450800mmol/L800mmol/L 无机无机：CaCl2，KCl, Ca(NO3)2 酶处理：酶处理： 酶浓度酶浓度 酶解时间酶解时间 酶解温度酶解温度 原生质体的纯化原生质体的纯化 （去除酶和非原生质体）（去除酶和非原生质体） 三种方法三种方法离心沉淀法离心沉淀法漂浮法漂浮法界面法界面法沉 淀 法 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行

32、过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。漂浮法原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底碎屑沉到管底。 离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生离心后碎屑沉到管底，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液培养基的界面上。培养基的界面上。界面法界面法500mmol/L蔗糖蔗糖 140mmol/L蔗糖蔗糖+360mmol/L山梨醇山梨醇原理

33、：原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。另一种溶液小于原生质体的密度。100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇山梨醇+原生质体原生质体原生质体一步酶解和沉淀纯化游离流程原生质体一步酶解和沉淀纯化游离流程离心离心去掉表皮去掉表皮原生质体沉降于底部原生质体沉降于底部过滤过滤吸去上层液吸去上层液酶解酶解粗原生质体液粗原生质体液加入清洗液加入清洗液离心离心吸去上层液吸去上层液加入培养基加入培养基离心离心吸去上层液吸去上层液加入培养基加入培养基取少量记数取少量记数纯化原

34、生质体液纯化原生质体液 原生质体的活力鉴定原生质体的活力鉴定 形态识别形态识别 形态完整、富形态完整、富含细胞质、颜色含细胞质、颜色新鲜的正常球形，新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，放入低渗溶液中，可正常膨大。可正常膨大。 FDAFDA (fluorescein diacetate(fluorescein diacetate， 二乙酸荧光素二乙酸荧光素) )： 本身不发荧光本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内质膜。活细胞内FDAFDA可以被酯酶裂可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质出来。荧光

35、素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累膜，在完整的活细胞内积累。使用浓度：使用浓度：0 0.01%01%荧光显微镜识别荧光显微镜识别(FDA(FDA法法) ) 酚藏花红染色法（酚藏花红染色法（0.1%)0.1%)酚藏花红能使无活力的原生酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。质体不着色。 伊凡蓝伊凡蓝(Evans blue)(Evans blue)染色法染色法(0.025%)(0.025%)有活力但受损伤的细胞和死细胞能有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。够摄取这种染料，活细胞不摄取。 氧电极法氧电极法 原生质体的培养

36、原生质体的培养培养基培养基特殊性：需渗透压稳定剂；膜的透性强，需要的特殊性：需渗透压稳定剂；膜的透性强，需要的营养成分更多；脆弱。营养成分更多；脆弱。无机盐：大量元素浓度；无机盐：大量元素浓度；NONO3 3和和NHNH4 4+ +的比例；的比例；CaCa2+2+浓度浓度有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。取物、水解酪蛋白。 激素：激素：NAANAA、IAAIAA、BABA与与2,4-2,4-D D渗透压渗透压：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等原生质体培养方法原生质体培养方法液体浅层培养法液体浅

37、层培养法v优点：优点： 原生质体在液体环境中有原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质较强的吸收营养物质的的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。转移培养物。v缺点：缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的原生质体之间的粘连现象粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。双层培养法双层培养法液体液体- -固体双层培养法

38、固体双层培养法 优点：优点： 固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。团的形成。 缺点：缺点： 不易观察细胞的发育过程不易观察细胞的发育过程。固体薄层培养法固体薄层培养法v 优点：优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。细胞团形成的全过程进行定点观察。v 缺点：缺点：固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟细胞分裂时间会推迟2d2d左右。左右。琼脂糖珠培养琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。 改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。原生质体培养条件 密度： 平板培养1