SHMT基因工程菌的构建方案

1、SHMT 基因工程菌的构建第四组一、实验相关知识1、丝氨酸 羟甲基转移酶是丝氨酸合成中的关键酶，能催化甘氨酸和丝氨酸的相互转化，具体的催化反应如下：SHMT甘氨酸 +N5,N10- 亚甲基四氢叶酸L-丝氨酸 +四氢叶酸在丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）作用下，甘氨酸同亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。该反应需要5-磷酸吡哆醛作为辅酶。N5,N10-亚甲基四氢叶酸上亚甲基可以来自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、胆碱和肌氨酸，它们同四氢叶酸反应生成N5,N10- 亚甲基四氢叶酸。本实验以甘氨酸和甲醇为前体物发酵生产L-丝氨酸时，菌体积累L-丝氨酸与菌体含有的SHMT 的活性直接相关，但由于 SHMT

2、的催化作用理论上是双向的， 有必要了解在相同的培养条件或者在本文所用的菌株 SHMT 是否具有双向催化作用。2、基因工程（genetic engineering ）又称基因拼接技术和 DNA 重组技术，是以分子遗传学为理论基础， 以分子生物学和微生物学的现代法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种 DNA 分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。 所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复

3、杂技术。 它是用人为的法将所需要的某一供体生物的遗传物质 DNA 大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的 DNA 分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、 繁殖的受体细胞中， 以让外源物质在其中“安家落户” ，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。3、丝氨酸 是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新代及肌肉的生长中发挥着作用， 因为它有助于免疫血球素和抗体的产生， 维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。 丝氨酸在细胞膜的制造加工、 肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。 大肠杆菌 细菌染色体DNA 的制备 （

4、预习案）一实训目的.学习并掌握细菌基因组的基本知识和提取法二实训原理及相关知识1. 大肠杆菌（ Escherichiacoli ，E.coli ） 革兰氏阴性短杆菌，大小 0.5 ×13 微米。身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几占粪便干重的1/3 。规定，每升饮用水肠杆菌数不应超过3 个大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原 （O ）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。2. 大肠杆菌常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎等等。 侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆

5、囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。3. 大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。 大肠杆菌的代类型是异养兼性厌氧型。4. 大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。5. 核酸：核酸DNARNA名称脱氧核糖核酸核糖核酸结构规则的双螺旋结构通常呈单链结构基本

6、单位脱氧核糖核苷酸核糖核苷酸五碳糖脱氧核糖核糖含氮碱基A、G、C、TA、G、C、U分布主要存在于细胞核， 少主要存在于细胞质量存在于线粒体和叶绿体携带遗传信息，在生物体的遗传、变异和蛋白主要功能质的生物合成中具有极其重要的作用6.作为遗传物质：只在 RNA 病毒中；不作为遗传物质：在 DNA 控制蛋白质合成过程中起作用。 mRNA 是蛋白质是合成的直接模板、 tRNA 能携带特定氨基酸、rRNA 是核糖体的组成成分；催化作用：酶的一种7. 基因组是指细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和，或原核生物染色体、质粒、真核生物的单倍染色体组、细胞器、病毒中所含有的一整套基因。8. 实训原理

7、提取 DNA 的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶 K 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿 / 异戊醇抽提分离蛋白质， 得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀使 DNA 从溶液中析出。 SDS 的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶 K 的重要特性是能在 SDS 和 EDTA（乙二胺四乙酸二钠） 存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取 DNA 的反应体系中， SDS 可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分离；而蛋白酶 K 可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分离出

8、来。 CTAB( 十六烷基三乙基溴化铵 )是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/LNaCl ）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀， 通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA ，而CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去。三实训试剂LB 液体培养基， LB 固体培养基， TE溶液，10%SDS，蛋白酶 K，5mol/LNaCl ， CTAB/NaCl溶液，酚 / 氯仿 / 异戊醇，异丙醇，70%乙醇四仪器设备超净台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、台式高速冷

9、冻离心机、恒温水浴锅、循环水真空泵、电子天平、冰箱、精密pH 试纸、微量移液器、离心管、试剂平、tip 头、吸水纸、标签纸、记号笔等。五实训步骤1. 菌种培养固体培养基：从活化的大肠杆菌斜面上挑取少量菌种，接种到一只新鲜的 LB 固体平板上，倒置在恒温培养箱中， 37 度培养1618h 。液体培养基：从活化的大肠杆菌斜面上挑取少量菌种，接种到一只装有 5ml LB 液体培养基的 250ml 三角瓶中，置于恒温摇床中， 37 度振荡培养过夜。2. 试剂的配置（ 1 ）、 LB 液体培养基：蛋白胨1.0g，酵母膏0.5g，NaCl1.0g，加蒸馏水使之充分溶解，滴加5mol/LNaOH调 pH 至

10、 7.0 ，补足水分至 100ml ，121 度高压蒸汽灭菌 20min ，冷却待用。（ 2 ）、 LB 固体培养基：蛋白胨1.0g ，酵母膏0.5g ，NaCl1.0g ，加蒸馏水使之充分溶解，再加琼脂粉1.5g ，加热融化，补足水分至100ml ，调 pH 至 7.0 ，121 度高压蒸汽灭菌 20min ，冷却待用。（ 3 ） TE 溶液：实验室所用的TE 缓冲液是终浓度分别为10mmol/LTris-HCl(pH8.0) 和 1mmol/LEDTA(Ph8.0) 的混合液。（4）10%SDS：称取 10.0g SDS 慢慢转移到约含 80ml 水的烧杯中，用磁力搅拌器或加热至 68 度

11、助溶，搅拌至完全溶解，用水定容至 100ml 。（5）蛋白酶 K：将 200mg 蛋白酶 K 加入到 8.0ml 无菌双蒸水中，轻轻摇动，直至蛋白酶 K 完全溶解。不要漩涡混合，加水定容到 10ml ，不需灭菌分装成小分，储存于 -20 度。（6）5mol/L NaCl ：在 80ml 蒸馏水中溶解 29.22g NaCl ，加水定容至 100ml ，分装后高压灭菌。（7）CTAB/NaCl 溶液：称取 4.1g NaCl 溶解于 80ml 蒸馏水中，缓慢加入 10g CTAB ，可加热至 65 度溶解，定容至 100mL 。（8）酚 / 氯仿 / 异戊醇（ 25：24：1）：按 1：1 的比

12、例混合用Tris饱和的酚与氯仿 / 异戊醇（ 24 ：1）。（9）其他试剂：异丙醇， 70%乙醇等。3. 制备细菌基因组（1）菌体收集：将2mL 培养至对数期的大肠杆菌DH5菌液 5000rpm 冷冻离心 10min 弃上清；（2 ）加 190 L TE 悬浮沉淀，并加 10 L 10%SDS， 1 L 20mg/mL 蛋白酶 K，混匀， 37保温 1h ；（3）加 30L 5mol/L NaCl，混匀；（4）加 30L CTAB/NaCl溶液，混匀， 65保温 20min ；（5）加入 300 L 酚/ 氯仿 / 异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心 10min ，将上清液移至干净离心管；（6）加入 300 L 氯仿 / 异戊醇（ 24：1）抽提，取上清液移至干净管中；（7）加 300L 异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min ，沉淀DNA；（8）5000rpm离心 10min ，沉淀 DNA ，加入 500 L70%乙醇， 5000rpm 离心 10min ，弃乙醇，吸干；（9）溶解于 20 LTE，取 3L 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20保存。六、实训注意事项1.称量时防试剂混杂，一把牛角匙用于一种试剂（或称取一种试剂后，洗净、擦干，再称取另一种试剂。）瓶盖不要盖错，及时贴上标签。2. 酚腐蚀性很强