血清外泌体对小鼠烫伤创面愈合的影响

1、    血清外泌体对小鼠烫伤创面愈合的影响    谢正+毛建文【摘要】目的 探讨血清来源的外泌体对小鼠烫伤伤口愈合的促进作用及机制。方法 提取、分离并鉴定鼠血清中的外泌体。选取nih小鼠建立皮肤深ii度烫伤模型。造模后用外泌体进行治疗，评估外泌体的疗效，观察皮肤组织的病理变化。检测血清外泌体对小鼠成纤维细胞增殖的影响以及血清外泌体对表皮hacat细胞迁移的影响。结果 成功建立小鼠深ii度皮肤烫伤模型。血清外泌体可以明显缩小烫伤疤痕的面积。且能有效修复皮肤的附属结构和改善胶原纤维的排列。血清外泌体也能促进成纤维细胞的增殖和表皮hacat细胞的迁移。结论 血

2、清外泌体能促进烫伤小鼠皮肤的愈合，有望为临床烫伤的治疗带来新方法。【关键词】血清外泌体；深ii度烫伤；细胞增殖；细胞迁移r644 b issn.2095-6681.2017.34.02烫伤是日常生活中一种常见的意外伤害，通常是由于不下心接触滚烫的液体或金属所致。尤其是儿童的安全意识较低，更容易接触一些高温物体。烫伤过后如果不及时处理烫伤伤口，就很有可能引起皮肤坏死，留下后遗症。烫伤后形成的硬痂不仅影响活动和外观，严重时甚至可以导致残疾1。烫伤后，皮肤内部毛细血管破裂，出现红肿，组织液渗出形成水泡2。外泌体因为存在于血液和组织液中，所以可以直接接触烫伤部位。外泌体是一种直径为40-100nm的纳

3、米级双分子层囊泡，外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，几乎分布于全身各处3。外泌体通过携带mrna，microrna和蛋白质等生物活性分子从而介导细胞间通讯，从而发挥多种功能4-5。血清是血液的主要成分之一，血清中含有大量的外泌体，而血清中外泌体在烫伤修复中的作用尚未有文献报道。本研究探讨了血清外泌体在小鼠烫伤愈合中的作用及其机理，为烫伤的修复治疗提供新的思路。1 实验方法1.1 血清外泌体的提取及鉴定抽取小鼠血液，静置1 h，离心2000 g，15 min后分离血清。离心2000 g，30 min去除细胞碎片，转移至新离心管中，每管分装1 ml血清。按赛默飞公司外泌体提取试剂盒说明

4、书上的步骤提取外泌体。电子透射显微镜观察外泌体的形态特征。western blot检测外泌体的特异性蛋白cd63和hsp70的表达。提取外泌体后，用bca法测蛋白样品的浓度后计算蛋白上样量，sds-page電泳后转膜，tbs/t洗三次，用脱脂奶粉室温封闭2 h，tbs/t洗三次后加入一抗（cd63，1：1000；hsp70，1：1000），冰箱4 孵育过夜。回收一抗后，tbs/t洗三次，加入相对应的二抗，室温孵育1 h。tbs/t洗三次，显影、定影。1.2 小鼠深ii度皮肤烫伤模型的建立及血清外泌体的治疗将体质量为1822 g的小鼠用10%水合氯醛麻醉后进行背部脱毛和皮肤消毒处理，随后将小鼠背

5、部贴放在烫伤装置上进行造模。烫伤装置由水浴锅和隔热木板组成，隔热木板上设有孔径为6 mm的圆洞。烫伤温度和时间后最终确定水浴锅温度设置为85，烫伤时间为8秒。在每只小鼠背部两侧各烫出一个直径为6 mm的圆形创面，随后在小鼠其中一侧烫伤部位周边注射100 ?l pbs重悬的外泌体，另一侧烫伤部位注射等量pbs，形成自身对照。每只小鼠造模后均单笼饲养。定期观察小鼠烫伤创面愈合情况。1.3 mtt实验将处在对数生长期的小鼠成纤维细胞以1.5×104个/ml的密度接种于96孔板，每孔100 ?l细胞悬液。设4组，每组3个复孔。待细胞完全贴壁后吸弃培养液，pbs洗3次。每孔加入100 ?l d

6、mem培养基。随后加入3种不同浓度的外泌体悬液，空白组加等量pbs。培养24h后，每孔加入mtt 20 ?l，培养箱中孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入150 ?l dmso，振荡10 min后用酶标仪检测吸光值。1.4 细胞划痕实验将处于对数生长期的表皮细胞hacat以25×104个/ml的密度接种于12孔板，每孔1 ml细胞悬液。设2组，每组3个复孔。待细胞贴壁后，用200 ?l枪头在每孔底部中间划一道细线，吸弃培养液，pbs洗3次。每孔加入1ml dmem培养基，随后两组分别加入外泌体悬液和等量pbs。培养24 h后，在显微镜下拍摄细胞迁移情况。1.5 统计学方法采用spss 2

7、0.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以“x±s”表示，采用t检验；计数资料以百分数（%），例（n）表示，采用x2检验；以p<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 外泌体的形态与鉴定血清外泌体在电镜下的形态为双分子层圆形结构。western bolt结果显示，外泌体试剂盒提取的血清外泌体可以检测出特异性标记蛋白cd63和hsp70。2.2 血清外泌体促进小鼠烫伤皮肤创面的愈合动物整体实验显示，相对于空白对照，血清外泌体能显著促进小鼠深二度烫伤创面愈合，缩短创面愈合时间。2.3 血清外泌体对成纤维细胞增殖的影响mtt结果显示：不同剂量的血清外泌体作用24 h后，可以促进

8、成纤维细胞的增殖，呈现剂量依赖性。pbs、2 ul exo、5 ul exo、10 ul exo组24 h的od值分别为（0.630±0.118）、（0.774±0.098）、（1.060±0.087）、（1.174±0.089）。10 ul/孔浓度的外泌体也呈时间依赖性地促进成纤维细胞的增殖。10 ul exo组的od值在0、1、2、3天分别为（0.563±0.084）、（1.110±0.159）、（1.364±0.208）、（1.408±0.159），pbs组的od值在0、1、2、3 天分别为（0.571

9、77;0.076）、（0.731±0.113）、（1.044±0.152）、（1.121±0.136）。endprint2.4 血清外泌体对表皮hacat细胞迁移的影响细胞划痕实验显示：血清外泌体可以显著地促进hacat细胞的迁移，外泌体组和pbs组在24 h的迁移率分别为（64.55±4.85）、（33.25±5.35）。外泌體组与pbs处理组的差异具有统计学意义（*p<0.01）。3 讨 论虽然外泌体早在在1983年就被发现6，但一直未受到人们的重视。然而通过近几年的研究，人们发现了外泌体在免疫中抗原呈递7、肿瘤的生长与迁移8、组织损

10、伤的修复9等多个领域的作用。在烫伤的修复过程中，烫伤的皮肤组织和细胞通常不能靠原来性质的细胞修复，而是由成纤维细胞增生来填补受损的组织，成纤维细胞的增殖对愈合速率有较大的影响。成纤维细胞通过大量增殖，合成和分泌的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补缺损坏死组织，为表皮细胞的覆盖创造条件10-11。在烫伤修复的最终阶段，随着硬痂的脱落，表皮细胞的迁移完成覆盖。我们的结果证实了血清外泌体能促进成纤维细胞的增殖，并能显示出量效关系和时效关系，并且本实验也显示血清外泌体能促进hacat细胞的迁移。然而，血清外泌体促进纤维细胞增殖和表皮细胞迁移的机制目前尚未明确，值得进一步的深入探

11、讨。本研究采用的是皮下注射给药，相对于涂抹的给药方式，不受皮肤通透性的影响。血清外泌体源于血液，相对于传统烫伤中成药而言，刺激性小，生物亲和性高，不会加重伤口的不适。我们的研究也显示血清外泌体对烫伤小鼠有较好的疗效的同时没有出现红肿等排斥现象。总之，我们的研究发现血清外泌体能促进小鼠烫伤创面的愈合，为临床皮肤烫伤的治疗提供了新的思路。参考文献1 ebrahim mk，bang rl，lari ar，et al. scald accidents during water aerosol inhalation in infantsj.burns.1990，16（4）：291-3.2 walker

12、ar.fatal tapwater scald burns in the usa，1979-86j.burns.1990，16（1）：49-52.3 skamagki m，zhang c，ross ca，et al.rna exosome complex-mediated control of redox status in pluripotent stem cellsj.stem cell reports. 2017， 9（4）：1053-1061.4 kim j，tan z，lubman dm.exosome enrichment of human serum using multiple

13、 cycles of centrifugationj.electrophoresis.2015，36（17）：2017-26.5 agarwal k，saji m，lazaroff sm，et al.analysis of exosome release as a cellular response to mapk pathway inhibition.langmuir.2015，31（19）：5440-8.6 johnstone rm，adam m，hammond jr，et al.vesicle formation during reticulocyte maturation.associ

14、ation of plasma membrane activities with released vesicles （exosomes）j.biol.chem.1987，262 （19）：941220.7 tkach m，kowal j，zucchetti ae，et al.qualitative differences in t-cell activation by dendritic cell-derived extracellular vesicle subtypesj.embo.2017，36（20）：3012-3028.8 hosseini-beheshti e，choi w，we

15、iswald lb，et al.tomlinson guns es. exosomes confer pro-survival signals to alter the phenotype of prostate cells in their surrounding environmentj.oncotarget.2016，7（12）：1463914658.9 zhang b，shi y，gong a，et al.hucmsc exosome-delivered 14-3-3orchestrates self-control of the wnt response via modulation of yapj.stem cells. 2016， 34（10）：2485-2500.10 mohsina a，kumar n