S20135415-刘思瑞-SSR 抗条绣基因

1、SSR标记技术在小麦抗锈病基因中的研究应用综述刘思瑞 作物 S20135415摘要：本文阐述了SSR分子标记技术的基本概念，技术路线以及一些基本知识。并且与小麦抗条锈病的研究相结合，展现出SSR标记技术在小麦抗锈病基因中的一些应用。为今后自己的野生二粒小麦抗锈病基因研究做知识储备。关键词：SSR 小麦 抗锈病基因 野生二粒小麦SSR markers research application in wheat rust resistance genes were reviewedLiu Si Rui Crops S20135415Abstract: This paper expounds the

2、 basic concept , technical route and basic knowledgeof SSR marker technology. And combined with the study of wheat resistance to stripe rust, show the SSR markers in wheat rust resistance genes in some applications. For the future own wild emmer rust resistance genes do knowledge reserves.Keywords:

3、SSR Wheat Rust resistance genes Wild emmer前言Simple sequence repeat(SSR)即简单重复序列标记技术，该技术利用生物基因组内(CA)n、(AT)n、(GCG)n等重复序列分布均匀且具有高度多态性的特点，作为基因的标记，广泛应用于构建遗传连锁图谱、分子标记辅助育种、系谱分析、研究群体遗传学、目标性状分子标记筛选等领域，获得了很好的成绩。在小麦条锈病的抗性基因研究中，SSR标记技术应用成熟，成功地找出了许多与抗性基因紧密连锁的分子标记，为小麦抗病育种做出了巨大的贡献。SSR概念和原理DNA在复制或者修复的过程中发生DNA滑动和错配或有

4、丝分裂、减速分裂期姐妹染色单体不均等交换产生SSR又称为微卫星DNA或短串联重复（STR）。SSR由几个碱基（大多数是16个）组成的基序串联重复而成，长度较短，在100bp以内，其重复单元多为两个核苷酸，也有一些重复单元为3，4个核苷酸，少数重复单元的核苷酸更多。SSR标记在基因组中具有高度的多态性，其原因一方面是因为不同遗传材料重复次数的可变性，另一方面是SSR的突变率很高（SSR的突变率在不同物种、在同一物种的不同位点和同一位点的不同等位基因间存在很大差异），从而产生了很多等位基因，导致了SSR的高度多态性。SSR丰富的多态性是其不稳定性的表现。SSR分布于全基因组的不同位置，但是其两端序

5、列多时保守的单拷贝序列，因为可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PRC技术将其间的核心SSR序列扩增出来，并利用电泳分析就可以直观获得其长度的多态性，这些多态性序列就是SSR标记。由于这些序列内部串联数目的不同，因此产生了SSR标记的高度多态。SSR技术的特点1. SSR标记技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点。2. 微卫星呈共显性遗传，符合孟德尔遗传规律。因此可用于鉴别杂合子和纯合子。3. SSR标记技术所需DNA量少，即使DNA降解，亦能有效的分析鉴定。4. SSR标记位点具有专化性。5. SSR标记数量丰富。标记覆盖整个基因组，而且分布均匀。6. 实验的重复性好，结果可靠性高

6、。7. SSR序列的两侧顺序常较保守，在同种而不同遗传型间多相同。8. 多数SSR无功能作用，增加或减少几个重复序列的频率高，因而在品种间具广泛的位点变异，比RFLP及RAPD分子标记具多态性。SSR技术路线DNA的提取和纯化PCR扩增扩增产物检测统计分析SSR标记技术使用的DNA质量要求较高，通常采用CTAB法，每次用量50120ng，所需量少，仅需微量组织即可。使用SSR标记的前提是已知重复序列两侧的DNA序列和设计引物。因此，引物对于SSR标记技术来说是至关重要，其来源主要有四种：第一，根据相关文献选择已有的引物；第二，选择近缘物种的引物；第三，根据基因组文库从中筛选出SSR位点两翼序列

7、设计的引物，常用的方法有经典法、微卫星富集法和省略库选法。经典法首先制备植物基因组DNA，建立基因组文库，然后利用含有SSR的探针杂交，再筛选阳性克隆测序，最后根据SSR两侧的DNA序列设计相应的引物。经典法又分为两种，分别是构建与筛选大插入片段基因组文库法和构建与筛选小插入片段基因组文库法。前者，缺点是多需要经过多次杂交筛选并且产生的亚克隆测序困难；后者缺点是SSR阳性克隆的得率很低。微卫星富集法是建立和筛选微卫星富集文库，提高SSR克隆的获得率。1996年，Fisher等人发明的5锚定PCR技术。利用5锚定简并SSR引物对基因组DNA进行扩增。2001年，Hayden和Sharp在该技术的

8、基础上发明了序列标签微卫星和选择扩增微卫星。第四，数据库搜寻法：利用SSR分析软件Sputnik与WisconsinGCG程序包中的FindPatterns程序，搜索EMBL、DDBJ和GenBank等公告数据库中的DNA序列和EST序列获得SSR序列。找到适合的引物之后，经过PCR扩增，对其产物进行检测。最常用的检测方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳，一般来说变性聚丙烯酰胺序列胶上分离效果会好于非变形胶，因为杂合个体在PCR后期的循环中会产生异源双链分子，导致出现杂带，影响等位基因的分析结果。此外，SSR位点的分离也可以在特殊的琼脂糖凝胶上进行。例如，美国FMC公司生产的NuSieve3:1(2%,3

9、%,4%)和MetaPhor琼脂糖适合于分离小鱼1kb的DNA,RNA和PCR产物。MetaPhord的分辨率为NuSieve3:1的两倍，2%4%的MetaPhord分辨率近似于4%8%的聚丙烯酰胺，可分离416bp的差异的DNA片段，适合于分析鉴定34个核苷酸重复序列的PCR产物。PCR产物经过电泳分离，以条带的方式呈现信息，任何类型的SSR分析都会产生等位基因和基因型频率的数据，因此可采用标准的群体遗传模式进行分析。根据研究目的的不同，最后采用的分析软件也有所差异，如用于遗传连锁图谱的mapmaker等1。分子标记技术在小麦条锈病抗病育种中的重要性小麦条锈病与白粉病、赤霉病并列为我国小麦

10、三大病害之一，是小麦产区的主要病害。条锈病在全国范围内均有发生，自1942年以来发生过11次大流行，大流行年份，感病品种一般减产30%左右，中度流行年份减产10%20%,特大流行年份减产高达50%60%,严重田块甚至绝收。目前，我国对小麦条锈病的最主要防治措施就是通过种植抗病品种，因此品种的选育对防治小麦条锈病至关重要。但是经过实践发现，在大规模统一种植抗病品种后，通常在35年内，品种抗性就会消失，田间出现新的生理小种的菌源，这决定着选育抗病品种不可能是一劳永逸的，必须每年不停的培育新品种，以对抗原品种抗性丧失的问题。近几年来，新的生理小种条中30（CY30）,条中31（CY31），条中32（

11、CY32），条中33（CY33）的产生使得原有的抗病品种抗性大规模丧失，急需培育新的小麦栽培品种，以防止小麦条锈病的大流行2。最初的小麦抗条锈病基因资源来自各地小麦之间的互相杂交，但是随着时间的推移，其本身和衍生后代都面临着抗性失去的威胁。目前更多的是引进近缘种的外源基因资源，主要的抗源来源于野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）、山羊草属(Agilops)、簇毛麦(Haynaldia villosa)。此外,中间偃麦草(Elytrigia intermedia)、山羊草属(Agilops)的许多种如尾状山羊草(Ae. Caudate)、卵穗山羊草(Ae. Ovata)、方穗

12、山羊草(Ae. Squarrosa)、高大山羊草(Ae. longissima)、粗山羊草(Ae. tauschii)、钩刺山羊草(Ae. Triuncialis)和长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum)等,都是条锈病的良好抗源,研究利用的潜力很大3。在研究小麦抗锈病基因的过程中，DNA分子标记技术被大量应用，应用较多的是RFLP、RAPD、SSR、AFLP和SCAR等标记技术。通过对小麦抗病基因进行标记，可以清楚的了解育种后代的抗性情况，以及对其遗传系谱做出分析，便于统计分析，使得育种效率提高。同时，因为分子标记可以清晰的表达出植物抗病性，进行基因聚合育种变得更加简单。国内外

13、许多研究表明,不同基因的聚合有助于提高品种的抗性和抗谱,培育出抗性相对持久的品种。而不同的小麦品种中存在着对不同条锈菌生理小种高抗或免疫的抗源,通过对不同抗源抗性基因的聚合,有望获得对多个条锈小种有效的广谱抗性基因型,是进一步提高品种抗性质量的有效途径之一。目前,通过基因聚合和分子标记辅助选择,已筛选到小麦抗白粉病、条锈病、黄矮病4, 5,水稻抗稻瘟病、抗衰老、抗白叶枯病等多基因聚合的新种质68。小麦抗条锈病基因的研究目前已经定位的小麦抗条锈病基因多数来源于普通小麦(T.aestivum)和小麦的近缘种。Yr1-Yr4、Yr6、Yr10-Yr14、Yr16、Yr18、Yr20-Yr23、Yr2

14、5、Yr27、Yr29、Yr30-Yr33、Yr34、Yr39来自普通小麦, Yr5来自六倍体斯卑尔脱小麦(T. speltoides),Yr7来自硬粒小麦(T. durum),Yr8来自顶芒山羊草(Ae. caudata),Yr9来自黑麦(S. cereal),Yr15、Yr35、Yr36来自四倍体野生二粒小麦 (T.dicoccoides),Yr17来自偏凸山羊草(T.Ventricosa), Yr19被认为可能来源于斯卑尔脱山羊草(Ae. sPeltoides),Yr24、Yr26Yr36来自圆锥小麦(T. turgidum),Yr28来自节节麦(T. tauschii), Yr25来自

15、二粒小麦(T. dicoccoides), Yr37来自粘果山羊草(Ae. kotschy),Yr38来自沙融山羊草(Ae.Sharonensis),Yr40来自尾状山羊草(Ae. caudata)9。近年找到的分子标记有, Sun等10找到SSR标记Xgwm501-2B与Yr5连锁,遗传距离为10.5-13.3 cM。姚占军11筛选出1个与Yr7紧密连锁的SSR标记Xgwms526,遗传距离为5.3 cM。Suenage等12和William等13进行了QTL研究,找到了与Yr18/Lr34紧密连锁的SSR标记Xgwm295.1与Yr29/Lr46遗传距离为5.6 cM的标记Xwmc44以及

16、与Yr30/Sr2/Lr27连锁的标记Xgwm389。McDonald14用遗传作图确定Yr27/Lr13/Lr23与RFLP标记Xbcd152-2B和Xcdo405-2B紧密连锁。Li等15将YrCH42定位于标记Xgwm498和Xbarc187之间,其遗传距离分别为1.6cM和2.3 cM。Li等16将YrZH84定位于分子标记Xcfa2040和Xbarc32之间,其遗传距离分别为1.4 cM和4.8 cM。Wang等17找到YrV23与SSR分子标记Xwmc356,其遗传距离为9.4 cM。Y. L.i等18将YrC591定位于Xcfa2040-7 B和SC-P 35M 48之间,其遗传

17、距离分别为8.0 cM和11.7 cM。杨敏娜等19将YrZhong22定位于Xwmc810和Xgdm116之间,其遗传距离分别为2.7 cM和4.4 cM。周艳丽等20筛选出一个与YrVir1连锁的SSR分子标记Xbarc349,其遗传距离为4.2 cM。房体麟等21将YrS2199定位于Xdp269和Xgwm120之间,其遗传距离分别为0.7 cM和11.0 cM。王金平等22筛选出一个与YrSn0096连锁的SSR分子标记Xbarc236,其遗传距离为5.0 cM。周新丽等23将YrV1定位于Xgwm566和Xgwm376之间,其遗传距离分别为3.6 cM和5.5 cM。张海泉等24将Y

18、rY212定位于Wmc506和Barc184之间,其遗传距离分别为3.0 cM和4.0 cM。Zhang等25找到与YrY206连锁的分子标记Wmc11a、Xgwm71c、Xgwm161和Xgwm183,其遗传距离分别为4.0、3.3、1.5、9.3 cM。Zhang等26找到与YrY201连锁的分子标记Xgwm273b、Xgwm37和wmc14,其遗传距离分别为11.9、5.8、10.9 cM。宋晓贺等27找到与YrLm1连锁的分子标记WMC671、GDM67和WMC150,其遗传距离分别为4.7、5.1、11.8 cM。杨敏娜等28找到与Yr88375连锁的分子标记Xgdm116和wmc8

19、10,其遗传距离分别为3.1 cM和3.9 cM。来源于野生二粒小麦的抗条绣病基因野生二粒小麦因其高铁锌含量，对白粉，条绣高抗的优异的表现被引入小麦育种，作为优良的基因资源被许多育种家使用。目前，在野生二粒小麦中利用SSR标记找到了4个抗条锈病基因，分别是Yr15、Yr35、Yr36、YrH52。Yr15基因被定位于1BS，代表材料是T.dicoccoides-G25，与之紧密连锁的SSR标记有Xgwm33。Yr35基因定位于6BS，代表材料T.dicoccoides479,暂无相关SSR标记。Yr36基因同样定位于6BS，是一种高温抗条锈病基因，代表材料Glupro，与Xbarc101完全连

20、锁。YrH52基因定位于1B，代表材料T.dicoccoides H52，连锁标记有Xgwm18和Xgwm264a。4种基因都为成株期抗病基因，对当前流行的条锈病生理小种CY3032都具有良好的抗性29。展望当前，培育新型抗条锈病小麦品种是生产中最经济，环保的方式。但是随着大规模单一抗病品种的栽培，逐渐凸显出了已育品种的抗性逐渐消失的问题。形成了育种丧失抗性再育种的循环，并且这一循环的年限在不断缩短，这值得育种工作者们重视。在培育抗病品种的同时，还要改变以往大规模单一抗病品种种植的错误模式，通过合理分布品种，实现小麦抗性的加强与延长。此外，小麦的近缘种属中含有丰富的小麦抗条锈基因，近年来育种工

21、作者愈来愈重视从小麦的近缘种属挖掘新基因，并将其导入普通小麦，以扩大普通小麦的抗源多样性。随着分子标记的广泛应用和标记技术的发展，越来越多的抗性基因获得了分子标记，甚至有的抗性基因获得了多个紧密连锁且类型不同的分子标记，这为建立高效的分子聚合育种技术体系，开展高通量分子聚合育种提供了良好的条件。目前小麦基因组测序计划正在进行中，小麦基因组测序的完成将有利于小麦抗条锈基因图位克隆工作的顺利开展。总之，分子育种技术将大大提高小麦条锈病抗性育种的效率，为生产创造出更多更好的抗条锈病小麦新品种。参考文献1周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用（第一版）M.北京,化学工业出版社，2004：1311

22、42.2侯明生.农业植物病理学（第一版）M.北京，科学出版社，2006：50553陈尚安,董玉琛,周荣华,等.小麦野生近缘植物抗病性鉴定 J.中国农业科学, 1990, 23(1): 54-59.4曾祥艳,张增艳,杜丽璞,等.分子标记辅助选育兼抗白粉病、条锈病、黄矮病小麦新种质J.中国农业科学, 2005, 38(12): 2 380-2 386.5SanchezA C, BrarD S,Huang N, et a.l Sequence tagged sitemarkerassisted selection for three bacterial blight resistancegenes

23、in riceZ.Crop SciSocAmerica, 2000: 40, 792-797.6邓其明,周宇爝,蒋昭雪,等.白叶枯病抗性基因Xa 21、Xa4和Xa23的聚合及其效应分析 J.作物学报, 2005, 31 (9): 1241-1246.7朱晓娜,陈耀锋,曹婷,等.小麦抗条锈基因聚合及抗条中32号基因分子标记筛选J.西北农林科技大学学报:自然科学版, 2008, 36(3): 880-884.8Lin F,Chen XM.Molecularmapping ofgenes for race-specific overall resistance to stripe rust in

24、wheat cultivar Express J.TheorApplGenet, 2008, 116(6): 797-806.9岳艳丽，姚占军，孙祥瑞，等.小麦抗条绣基因的研究进展J.种子（Seed）,2009,28(10):5862.10姚占军,蔺瑞明,徐世昌,等.小麦条锈菌鉴别寄主Lee中抗性基因Yr7的微卫星标记J.中国农业科学, 2006, 39 (6): 1146-1152.11Suenaga K, Singh R P,Huerta-Espino J, et a.l Microsatellite markers for genes lr34/yr18 and other quanti

25、tative traitLoci for leaf rust and stripe rust resistance in bread wheat. J. Phytopathology. 2003, 93(7): 881-890.12W illiam M, Singh R P, Huerta-Espino J, et a.l Molecular markermapping of leaf rust resistance gene lr46 and its association with stripe rust resistance gene yr29 in wheatJ. Phytopatho

26、logy, 2003, 93(2): 153-159.13Mcdonald D B,McintoshR A,WellingsC R, eta.l Cytogenetical studies inwheatXIX.Location and linkage studies on gene Yr27 for resistance to stripe (yellow) rust J. Euphytica. 2004, 136(3): 239-248.14LiG Q,Li Z F,YangW Y, et a.lMolecularmapping of stripe rust resistance gene

27、YrCH 42 in Chinesewheat cultivarChuanmai42 and its allelism withYr24 andYr26J.TheorAppl Genet, 2006, 112(8): 1 434-1 440.15Li Z F, Zheng T C,He Z H, et a.l Molecular tagging of stripe rust resistance geneYrZH84 in Chinesewheat line Zhou 8425 BJ. TheorApplGenet, 2006, 112(6): 1 098-1 103.16WangY B,Xu

28、 S C,Xu Z, eta.l Amicrosatellitemarker linked to the stripe rust resistance gene YrV 23 in the wheat variety Vilmorin 23J.YiChuan, 2006, 28(3): 306-310.17LiY, Niu Y C, Chen X M.Mapping a stripe rust resistance gene YrC 591 in wheat variety C 591 with SSR and AFLP markersJ.TheorApplGenet, 2009, 118(2): 339-346.18杨敏娜,徐智斌,王美南,等.小麦品种中梁22抗条锈病基因的遗传分析和分子作图 J.作物学报, 2008, 34(7): 1280-1 284.19周艳丽,蔺瑞明,张建周,等.小麦条锈菌中国鉴别寄主维尔中抗条锈病基因YrVi