CHIKV NSP1蛋白表达及多克隆抗体制备实验

1、CHIKV NSP1蛋白鼠源多克隆抗体的制备一：实验目的制备针对CHIKV NSP1的鼠源多克隆抗体二：实验材料1. pET28a-CHIKV-NSP1的Rossata菌株2IPTG,超声裂解液，蛋白纯化试剂等三：实验动物小鼠四：实验技术路线1 诱导NSP1蛋白表达，并对目的蛋白进行纯化；2 将纯化后的CHIKV C蛋白免疫小鼠；3 免疫后收集血清，利用western-blot检测能否与天然病毒蛋白NSP1结合；五：实验方法1. 进行CHIKV- NSP1蛋白诱导表达用5ml kan抗性LB培养基复苏Rossata菌株，37，220转分摇床培养至OD值为0.6-0.8时，转接入30mlkan抗

2、性LB培养基中。37，220转分摇床培养至OD值为0.6-0.8时按终浓度为0.8mM的浓度加入IPTG进行诱导表达，16，220转分，诱导12小时。配制：超声裂解液（1L）50mM Tris（PH7.4）+150 mM NaCl+2 mM EDTA+0.1% Triton X-100Tris-base: m=CMV=50×10-3×121.14×1=6.057gNaCl: m=CMV=150×10-3×58.44×1=8.766gEDTA: m=CMV=2×10-3×372.2×1=0.7444gTri

3、s-base、NaCl和EDTA加入900ml ddH2O溶解后，用HCl调节PH为7.4，最后补足至1L。将诱导后的细菌，4000转分，4离心15分钟，收集菌体。获得的菌体沉淀用4预冷的PBS（PH 7.4）洗涤3次，每次4000转分，4离心15分钟。洗涤后的菌体，按原始培养体积110的比例加入超声裂解液，冰浴超声破碎细胞（工作时间2秒，暂停时间5秒，功率400W，工作次数198次）。超声裂解后的菌体，12000转分，4离心15分钟，分别收集上清液和沉淀，加入SDS-PAGE上样缓冲液处理后电泳，确定目的蛋白表达的形式（可溶性表达或者包涵体形式表达），纯化目的蛋白。六 免疫动物制备多抗（参考

4、动物房兔源多抗制备方案）试验动物：小鼠，免疫前采血制备阴性血清免疫次数：3次免疫间隔时间：2周免疫抗原量：每次50-100g，体积100-200ul（不超150ul），等量加佐剂，每只小鼠每次注射总体积不超300ul第3次免疫后两周，采血1ml分离血清，作为一抗，利用western-blot检测是否能与天然蛋白CHIKV 非结构蛋白结合。如果结合良好，即可剖杀收集血清。七 实验结果（1） 16,12h IPTG诱导质粒pET-28a(+)-CHIKV- nsp1的Rossata菌株，实验结果如下：M: Protein marker 1: Before induction by TPTG 2:

5、After induction by IPTG 3 The supersonic lysate 4:Supernatant after supersonic lysate 5:Precipitation after supersonic lysate（2） 采用HIS柱纯化，试验结果如下：M: Protein marker 1: Before induction by TPTG 2: After induction by IPTG 3 The supersonic lysate 4: filtrate 5: purified protein最终获得约800l纯化蛋白，经测定浓度为（0.703+

6、0.773+0.712）/3 mg/ml（3） 重新摇菌，利用AKTA层析仪进行纯化。按照以上配方，配制Lysis/Elution buffer（Lysis低咪唑，Elution高咪唑）。复苏后摇菌（pET-28a(+)-CHIKV- nsp1的Rossata菌株）700ml。当OD=0.62时，取诱导前菌液样品1ml留作备用。加入IPTG至终浓度为0.8mM，16,诱导12h ，诱导后OD=2.02,取样1ml备用跑胶。取2ml菌液分装2个EP管（每管各装1ml），4离心12000rpm，5min，弃上清，分别加入300ul Lysis buffer，超声裂解，工作时间3秒，暂停时间3秒，分

7、别处理20min裂解。取其中1管，12000rpm，4离心，5min，分别收集上清和包涵体，包涵体加入300ul Lysis buffer重悬。每孔各加20ul，跑胶鉴定如下：nsp1部分表达于上清中。M: Protein marker 1：诱导前 2：诱导后 3：破碎液 4：上清 5：包涵体700ml菌液5000rpm离心10min，弃去培养基。直接用50ml Lysis buffer重悬菌体，存放入50ml离心管（本次试验由于时间问题，将重悬液冻入-80冰箱3天，纯化时，在常温自来水浴中解冻）。压力破碎：破碎前，顺次用蒸馏水、Lysis buffer洗压力破碎仪，1000ba压力破碎直至液

8、体澄清，破碎完顺次用Lysis buffer、蒸馏水洗压力破碎仪。破碎后，17000rpm，4离心50min，取上清，弃去包涵体。AKTA纯化：0.22um过滤上清至上样杯中，本实验设置10%（10% Elution buffer，即50mmol咪唑）、20%、30%、60%、100%五个咪唑梯度进行纯化，跑胶鉴定如下：M: Protein marker 1：破碎后上清液 2：流穿液 3：10% 4：20% 5：30% 6：40% 7-8: 100%洗脱的不同部分对20%，30%洗脱波峰处蛋白进行超滤浓缩，3500rpm 4离心30min，体积由10ml浓缩为1ml。加入1×PBS 10ml,浓缩至1ml，重复4次，以达到除去咪唑和盐份的目的，滤液分别标为滤液一、滤液二、滤液三和滤液四。以滤液四为空白，测定浓缩蛋白的浓度为(1.291+1.325 +1.265)/3=1.294 mg/ml。M: Protei