蛋白质组学定量研究常见方法ppt课件

1、蛋白质组学定量研讨常见方法 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663蛋白质组学定量研讨常见方法蛋白质组学定量研讨常见方法o1 1：常规双向电泳：常规双向电泳o2 2：DIGEDIGEo3 3：15N15N等同位素标志等同位素标志o4 4：ICATICATo5 5：iTRAQiTRAQo6 6：SILACSILAC 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631：常规双向电泳：常规双向电泳o一、双向电泳概述：一、双向电泳概述：o 双向电泳双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)(Two-dimensional el

2、ectrophoresis)的根本原理的根本原理是利用蛋白质的等电点是利用蛋白质的等电点pI)pI)和分子量和分子量(Mr)(Mr)不同而分别蛋白质：第一向电不同而分别蛋白质：第一向电泳泳等电聚焦等电聚焦Isoelectric FocusingIsoelectric Focusing，IEFIEF根据蛋白质的等电点不根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分别，第二向电泳同将蛋白质分别，第二向电泳十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, Sodium Dodecyl

3、 Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDSPAGESDSPAGE利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分别。利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分别。o 双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分别上千双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分别上千种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能经过质谱鉴定和软件分析获得。因此其电点，分子量和含量的信息都能经过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差别分析、

4、药物开发、癌症研在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差别分析、药物开发、癌症研讨等领域都得到了广泛的运用。讨等领域都得到了广泛的运用。o二：双向电泳分别蛋白质混合物具有以下优势：二：双向电泳分别蛋白质混合物具有以下优势：o 1 1、经典方法、运用范围广、适用于各类资料；、经典方法、运用范围广、适用于各类资料；o 2 2、经济实惠，可大规模多个样本挑选和分析。、经济实惠，可大规模多个样本挑选和分析。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16631 1：双向电泳：双向电泳 基于2D-PAGE的经典定量分析方法。 1、样品预备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。 2、蛋

5、白质分别：蛋白质经过2D-PAGE分别后染色银染、考染等。 3、蛋白质的定性与定量分析：经过与对照组相Image Master 7.0分析出实验组中差别点，质谱鉴定差别点蛋白质,同时运用软件分析出其表达量的变化。2 2：DIGEDIGE 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-1663简介：简介： DIGE 双向荧光差别凝胶电泳，利用荧光染料双向荧光差别凝胶电泳，利用荧光染料Cy2, Cy3, Cy5能与蛋白质赖氨酸的氨基反响而使蛋白质被标志，标志后蛋白能与蛋白质赖氨酸的氨基反响而使蛋白质被标志，标志后蛋白质的等电点和分子量根本不受影响，等量混合标志好的蛋白质后进展质的等电点

6、和分子量根本不受影响，等量混合标志好的蛋白质后进展双向电泳，蛋白质表达量的变化那么经过不同荧光的强度来表达。双向电泳，蛋白质表达量的变化那么经过不同荧光的强度来表达。技术优势：技术优势： 1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了任务量；：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了任务量； 2：与常规银染相比灵敏度更高；：与常规银染相比灵敏度更高； 3：检测动态范围更大；：检测动态范围更大； 4：定量准确：定量准确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差；采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差； 5：统计学分析，：统计学分析，ImageMaster7.0DIGE软件可以得到统软件可以得到

7、统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏向。计学可信的结果，降低了操作者之间的偏向。2 2：DIGEDIGE DIGE荧光定量方法流程图. 1、样品预备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标志，同时将一切实验组与对照组的样品等量混合后cy2标志，作为内标。 2、蛋白质分别：等量混合三种荧光素标志后的蛋白质，2D-PAGE电泳分别，荧光显色。 3、蛋白质定量分析：Image Master 7.0DIGE)分析同一蛋白质不同处置后的表达量变化。3 3：代谢标志法：代谢标志法15N15N标志法标志法简介：简介： 在培育基中添加在培育基中添加15N15N，细胞经过假设干代培育后，蛋

8、白质将完全被同位素标志，等，细胞经过假设干代培育后，蛋白质将完全被同位素标志，等量混合标志与没有标志同位素的样本、液相色谱和量混合标志与没有标志同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGESDS-PAGE分别，质谱鉴定和定量。分别，质谱鉴定和定量。 根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判别出同一肽段在不同样品中的含量变化，根根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判别出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进展序列测定从而鉴定蛋白质。据二级谱图对肽段进展序列测定从而鉴定蛋白质。优点：优点： 高效性：高效性：15N15N标志法是体内标志技术，标志效率可高达标志法是体内标志技术，标志效率可高达95%9

9、5%； 重现性：降低由于样品制备不同而呵斥的实验内差别；重现性：降低由于样品制备不同而呵斥的实验内差别； 灵敏性：在培育基中添加同位素标志灵敏性：在培育基中添加同位素标志15N 15N ，操作方便。，操作方便。缺陷：缺陷： 1 1只需知蛋白质的氨基酸序列，才可以对只需知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N14N/15N标志的蛋白质或肽段的相应质标志的蛋白质或肽段的相应质量位移进展预测。量位移进展预测。 2 2由于运用的由于运用的15N15N培育基纯度培育基纯度96%96%，无法完全置换，无法完全置换14N,14N,所以所以15N15N标志的肽段在质谱标志的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。

10、中会有额外的同位素峰。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16634 4：化学标志法：化学标志法ICATICATA: ICAT试剂构造，包括3个部分，SH反响集团， biotin标签，同位素臂，试剂具有两种方式：重型含8个氘和轻型不含氘B: ICAT标志定量技术流程，来源不同处置的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂标志，标志后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标记的多肽，质谱分析，根据MS质谱峰图强度进展定量，MS/MS鉴定肽段。4 4：化学标志法：化学标志法ICATICATICATICAT法的缺陷：法的缺陷： 1 1它不能用于标志不含半胱氨酸或半

11、胱氨酸含量低的蛋白质。它不能用于标志不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 2 2ICATICAT分子量相对较大约分子量相对较大约500Da500Da，与蛋白质衔接后能够会呵斥分子，与蛋白质衔接后能够会呵斥分子的空间位阻的空间位阻 3 3ICATICAT分子量相对较大约分子量相对较大约500Da500Da，由于在，由于在MSMS分析中标签仍保管在每分析中标签仍保管在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸个肽上，使得在碰撞诱导解吸CID)CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标志肽段的过程复杂化，异化的片段离子就会使串联质谱分析标志肽段

12、的过程复杂化， 4 4 ICAT ICAT分子量相对较大约分子量相对较大约500Da500Da，这对小肽而言是一个较大的修饰，这对小肽而言是一个较大的修饰物，会添加数据库搜索的复杂性物，会添加数据库搜索的复杂性 5 5标志时通常需求延伸时间来保证标志时通常需求延伸时间来保证ICATICAT与蛋白质充分结合，这能够会呵与蛋白质充分结合，这能够会呵斥赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸部分衍化。斥赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸部分衍化。 6 6与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，能够会自发发生与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，能够会自发发生-消除反响消除反响使部分标签断裂。使部分标签断

13、裂。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16635: 化学标志法iTRAQ简介：简介： iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基衔接的胺标志同重元试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基衔接的胺标志同重元素。在质谱图中，任何一种素。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标志不同样本中的同一蛋白质表现为一试剂标志不同样本中的同一蛋白质表现为一样的质荷比。样的质荷比。 在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不的峰，因此根据波峰的高度及面积，

14、可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处置的定量信息。同处置的定量信息。iTRAQ 构造构造 iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反响部分、平衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标志8组样品。 2、肽反响部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价衔接而标志上肽段，几乎可以标志一切蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标志的同一肽段的质荷比一样。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16635: 化学标志法iTRAQ与传统基于双向电泳定量分析相比，与传统基于双向电泳定量分析相比，iTRAQiTRAQ具有以下技术优势：具有以下技术优势：1 1：灵敏度高，检测限低，可检

15、测出低丰度蛋白；：灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白；2 2：分别才干强：分别才干强, ,分析范围广分析范围广,iTRAQ,iTRAQ可以对任何类型的蛋白质进展鉴定，可以对任何类型的蛋白质进展鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。白。3: 3: 高通量：同时对高通量：同时对8 8个样本进展分析，提高了实验通量，可同时对多个样本进展分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处置的蛋白质进展分析；个时间点或不同处置的蛋白质进展分析； 4 4：结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；：结果可靠：定性与定量分析结

16、果更加可靠；5 5：自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分别：自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分别效果好。效果好。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16635: 化学标志法iTRAQ iTRAQ法。 1：样本经过不同处置后，提取蛋白质; 2：蛋白质经过复原，封锁后胰蛋白酶酶切; 3：肽段混合物分别用不同的iTRAQ标志; 4：等量混合各种iTRAQ试剂标志的肽段; 5：MS/MS质谱检测及分析。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16636: SILAC6: SILACoSILAC即细胞培育条件下稳定同位

17、素标志技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其根本原理是在细胞培育时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培育基进展细胞培育，用于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是Lys和Arg, 细胞在传代培育过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质，细胞经传代培育5-6代后，细胞的一切蛋白质将被同位素标志，等量混合标志的蛋白质后经过SDS-PAGE分别和质谱分析，经过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进展相对定量，同时二级谱图对肽段进展序列测定从而鉴定蛋白质。o由于SILAC标志技术是体内标志技术，几

18、乎不影响细胞的功能，同时灵敏度高，因此其在蛋白质组学相关领域中得到了广泛的运用，如比较蛋白质组学，蛋白质与蛋白质相互作用，蛋白质与DNA相互作用，蛋白质与RNA相互作用等领域。 辉骏生物：fitgene/ 免费效力热线：400-699-16636: SILAC6: SILAC 技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法 1高效性：SILAC是体内标志技术，标志效率可高达100%； 2定量准确：线性范围广，降低由于样品制备不同而呵斥的实验内差别； 3高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级程度； 4相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培育基中可以培育的细胞或细菌中表达的蛋白进展标志； 5灵敏性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培育基中添加同位素标志