活化Notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化体外探究

1、活化notch2信号促进高糖条件下破骨细胞分化体外探究摘要目的探讨活化notch2信号对高糖条件下核因子 kb受体活化因子配体（rankl）诱导破骨细胞分化的影响，初步明确notch2信号在髙糖条件下破骨细胞分化中的 作用。方法体外培养小鼠破骨前体细胞，在高糖条件下采 用rankl刺激破骨前体细胞。实验分为葡萄糖和甘露醇等渗 对照组，每组设5个浓度（0、5、10、20、40 mmol l-1）,通过实时定量聚合酶链反应检测notch2基因的表达水 平，抗酒石酸酸性磷酸酶（trap）染色检测破骨细胞分化情 况。构建含notch2细胞内片段（icn2 ）的病毒载体 （pmx-icn2）,转染包装细

2、胞，收获病毒上清液感染破骨前 体细胞；将病毒载体分为icn2-oe （icn2过表达）和empty （仅感染pmx载体）两组，通过蛋白质印迹法检测icn2蛋 白的表达水平；并在高糖条件下（20.40 mmoll-1）用rankl 刺激icn2-0e和empty组，设甘露醇等渗对照组，用trap 染色检测破骨细胞分化情况。结果rankl诱导破骨细胞分化过 程中，葡萄糖浓度为20、40 mmoll-1时，破骨细胞数分 别为110. 3±6. 8和72. 0±8. 0, notch2相对表达量分别为 1. 65±0. 23 和 1. 10±0. 11； 20、

3、40 mmol lt 甘露醇组的 破骨细胞数分别为152. 7±7. 0和157. 0±12.5, notch2相 对表达量分别为2. 82±0. 28和2. 42±0. 27,组间差异有统 计学意义（p0. 05）；葡萄糖浓度分别为5、10 mmoll-l时与等渗 甘露醇组间的差异无统计学意义（p>0.05）,随着葡萄糖浓度的继续升高，破骨细胞数目减少，葡萄糖浓度为 20、40 mmoll-1时与等渗甘露醇组间的差异具有统计学意 义（p0. 05）；葡萄糖浓度分别为5、10 mmoll-1时与等渗 甘露醇组间表达的差异无统计学意义（p>0.

4、05）,随着葡萄 糖浓度的继续升高，notch2受体表达逐渐降低，葡萄糖浓度 为20、40 mmoll-l时与等渗甘露醇组间的差异具有统计 学意义（p0.05）。该结果提示高糖环境可以抑制rankl诱 导的notch2受体表达。2.3活化notch2信号促进高糖环境下rankl诱导的破骨细胞分化pmx-icn2表达载体经xba i酶切，得到预期大小分别 为1 587、2 619、4 299 bp的片段，结果如图2所示，初 步表明逆转录病毒载体pmx-icn2构建成功。对dna测序结 果进一步分析表明此重组表达载体构建正确。从图3中可看 出：与empty组（感染pmx空载体病毒上清液）细胞相比，

5、 icn2-0e的icn2表达水平升高，该结果提示notch2信号被 活化。从表3中可以看出：活化notch2信号后，甘露醇浓 度为20、40 mmollt 时，icn2-0e组破骨细胞数量多于 empty组，两组间的差异有统计学意义(p0.05)；葡萄糖浓度为20、40 mmoll-1时，icn2-0e组破骨细 胞数量多于empty组，两组间的差异具有统计学意义 (p<0. 05)；但是在 20、40 mmol l-1 时，icn2-0e 组破骨 细胞数量少于对照组(等渗甘露醇浓度组)，且二者间的差 异具有统计学差异(p0.05)。该结果提示活化notch2信号不但可以促进高渗状态下r

6、ankl诱导 的破骨细胞分化，而且可以促进高糖环境下rankl诱导的破 骨细胞分化，但活化notch2信号不能够完全阻止高糖对破 骨细胞分化的抑制作用，说明可能有多种信号途径参与了高 糖抑制破骨细胞分化的过程。3讨论国内外有关高糖刺激对体外破骨细胞分化影响的研究 结果仍不一致。一方面，有研究5表明高浓度葡萄糖通过提高破骨前体细胞表面核因子kb受体 (re-ceptor activator of nuclear factor kappa b, rank) 的表达水平，从而促进rankl诱导破骨细胞的分化及其骨吸 收功能；另一方面，也有研究6表明高浓度葡萄糖通过降低细胞核因子k b (nuclea

7、r factor kappa b, nf-kb)的活性而抑制破骨细胞分化。破骨前体细胞在向破骨细胞分化的过程中，受到多种信 号通路的精确调控以及所处微环境的综合影响。破骨前体细 胞向破骨细胞分化及其骨吸收过程中，需要葡萄糖作为基本 的能量代谢物质。根据预实验结果和以往的文献报道7, 人体内正常血糖浓度大约为5. 5 mmoll-1,本实验选择葡萄糖浓度为5、10、20、40 mmollt的a-mem培养基培养破骨前体 细胞。从本实验的研究结果可以看出，各组均有破骨细胞形 成，随着葡萄糖浓度的升高，多数实验组破骨细胞的数量少 于等渗对照组，二者间差异具有统计学意义。这说明rankl 能诱导破骨前

8、体细胞向破骨细胞分化，而高糖环境可以抑制 破骨细胞分化，并且呈现出浓度依赖性，总体趋势是浓度越 大，抑制破骨细胞分化的能力越强。破骨细胞分化的机制是一种复杂的多水平调控机制 8-9,多因素相互作用可以促进或抑制破骨细胞的分化。 对破骨细胞分化调控机制的探讨是国内外的研究热点。 notch信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之 一，参与调控细胞的增殖、分化等生物学过程。经典notch 信号通路由受体配体相互作用后，导致notch受体胞内段icn 从膜上释放，icn进入细胞核，将与dna结合的抑制蛋白转 化为转录激活因子，激活下游靶基因的表达10。notch信 号通路的关键核转录因子rbp-

9、j和nf-kb通过竞争性与活 化 t 细胞核因子 1 (nuclear factor of activated t-cell 1,nfatcl)启动子区域结合，在rankl诱导破骨细胞分化 过程中发挥重要的调控作用3。利用丫-分泌酶抑制剂阻断notch信号或是通过shrna干扰阻断notch2 信号可抑制rankl诱导的破骨细胞的分化过程，而活化 notch2信号可促进rankl诱导的破骨细胞分化过程。由于破 骨前体细胞主要表达notch2受体3,提示notch信号的综合效应可能为正向调控rankl诱导破 骨细胞分化过程。本实验结果提示，随着葡萄糖浓度的升高, 实验组细胞表面notch2受体的

10、表达水平低于对照组，二者 之间差异具有统计学意义。这说明rankl能提高细胞表面 notch2受体的表达水平，而高糖环境可以抑制notch2受体 的表达，提示notch2信号可能参与调控高糖环境下rankl 诱导的破骨细胞分化过程。目前，notch2信号在高糖状态下，对破骨细胞分化的调 控作用还少有研究。已有研究表明，外源性notch分子胞内 区组成性活化形式icn的表达与notch配体激活notch受体 后对靶细胞的作用相类似，外源性icn基因在靶细胞持续表 达导致notch信号过度活化11-12 o因此，本实验研究通 过逆转录病毒系统将具有notch2活性的胞内片段icn2导入破骨前体细胞

11、，观 察高糖条件下，活化notch2信号对破骨细胞分化的影响。 本实验结果提示，活化notch2信号后，在相同的葡萄糖浓 度下，实验组破骨细胞的数量多于对照组（转染空载体），二者间差异具有统计学意义。该结果说明激活notch2信号能促进高糖条件下破骨细 胞的分化，提示notch2信号可能正向调控髙糖环境下破骨 细胞的分化过程。结合考虑高糖抑制nf-kb活性的研究结 果，notch2信号可能与nf-kb具有协同作用，可见高糖作 用下破骨细胞的分化机制相当复杂，除上述因素外，还有其 他信号参与其中。致谢：感谢日本福冈齿科大学分子生物学系冈部幸司教 授在本课题实施中给予的大力帮助！参考文献1 tei

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