毛细管电泳技术在功能化中药指纹图谱中的研究

1、毛细管电泳技术在功能化中药指纹图谱中的研究摘要：通过指纹图谱建立疗效与化学成分的关联，探索指纹图谱与药效的联系，阐明色谱图中指纹峰、特征峰与中药功效的关系，可从中药疗效的角度出发，全面地研究中药的各种活性成分，建立“谱”“效”关系，毛细管电泳技术无疑是一种很有应用前景的方法，它可以从整体上表征中药组分的特征,同时可以从整体上表征中药组分与受体发生相互作用前后组分种类与数量的变化, 全面评价其质量的优劣，是一种科学的中药质量控制的新模式。关键词：功能化；中药指纹图谱；毛细管电泳技术1 毛细管电泳技术在功能化中药指纹图谱的意义1.1 功能化中药指纹图谱功能化中药指纹图谱1(TCM-FP)指中药材经

2、过适当的处理后，获得其中的物质基础，采用现代分析技术，对物质基础进行化学物质信息的表达，并与这些化学物质的药理学参数或药效学表达进行关联，通过能够表示该中药材特性的共有峰的图谱和相关数据进行“谱”“效”关系的表征。1.2 药效学表达或药理学参数在现代生理学、药理学研究中，常常选用一些指标对药物的疗效以及机体对药物的反应进行定性定量的描述。药物分子与生物大分子的结合常数Kb可评价药物与受体的结合程度、强度，可用于活性成分的初步筛选。药物在体内各种pH值环境下存在状态的解离常数pKa在药理学上可以为在分子水平上研究药物的吸收、传送及与受体结合提供重要的信息。此外，药物在体内的油水分配系数logPo

3、w，可为化合物的跨膜转运能力提供有益的参考。亦可利用对复杂样品中未知化合物的某种官能团的识别，从一定程度上评价该复杂样品的某种活性。1.3 毛细管电泳技术的优势毛细管电泳技术2（Capillary Electrophoresis，CE）是离子或荷电粒子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度、分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳技术。CE的特点：1、多分离模式多，使得其分离对象范围广，几乎涵盖了中药中存在的所有组分；2、快分析速度快，分析时间一般为几十秒到几分钟；3、好分离效能好，每米理论塔板数在105以上； 4、省分析费用省，进样体积小，一般为纳升级。一种中药材通常含有多种有效成分,其化学组分

4、结构复杂,种类繁多，而且在药材中含量往往不高,采用普通的分离分析方法难以实现完全的分离和定量测定；要想整体地研究中药的各种活性化学成分，建立“谱”“效”关系，CE则不失为一种对中药复杂多组分进行同时分离分析的有效手段，同时可以从整体上表征中药组分与受体发生相互作用前后组分种类与数量的变化,初步反映中药组分的药理作用机制。2 毛细管电泳技术在功能化中药指纹图谱中的应用2.1 CE在中药活性成分研究中的应用据报道，目前主要研究的中药活性成分有以下六大类：生物碱类、黄酮及黄酮苷类、有机酚酸类、蒽醌类、香豆素类及皂苷类 2。2.11 生物碱类（Alkaloids）生物碱在自然界中分布很广，一般都具有强

5、烈的生理活性，有些甚至有巨毒（如乌头中所含的乌头碱）。因此建立生物碱的分析方法就显得十分重要。在中草药的毛细管电泳分析中，它是被研究得最多的一类标志性化合物。由于生物碱在低pH下通常荷正电，所以生物碱常常能在pH低于7的缓冲溶液中得到分离分析。目前多采用CZE模式来分析中药中的生物碱。李琴韵等3采用CZE法对中国药典收载的3个不同品种的14个吴茱萸样品(不同产地)中所含吴茱萸碱进行含量测定,同时还在两种波长下,建立了吴茱萸样品的高效毛细管电泳色谱指纹谱,能将3种不同品种的吴茱萸明显地区分,揭示了其内在质量,方法准确、简便。2.1.2 黄酮（Flavonoids）及黄酮苷类（Flavonoid

6、Glycosides）黄酮类化合物大多是中性分子，多采用MECC及CZE两种模式分离，而其中以MECC为多。台湾的Lin Yingmei4等报道用MECC模式分析黄芩中黄酮成分，并将黄芩中6种主要黄酮类化合物进行了分离，线性关系较好。2.1.3 有机酚酸类（Organo - Phenolic Acids）有机酚酸类成分解离后带负电荷，以CZE模式分析时在中性成分后出峰，分析时间较长。可在缓冲液中加入阳离子表面活性剂CTAB(十六烷基二甲基季胺溴)等，将电渗流(EOF)改向，称逆电渗流(Reversed EOF)，使出峰顺序先后依次为负离子，中性分子、正离子，可缩短分离时间。范国荣等5进行了四倍

7、体板蓝根中五种有机酸成分的毛细管电泳分离分析。此方法大改善了HPLC法的分析成本高，溶剂有毒等缺点，并且提高了灵敏度。2.1.4 蒽醌类（Anthraquinones）蒽醌类成分是许多中药的有效成分，尤以二元或三元羟基蒽醌及它们的衍生物广泛存在于植物性的泻药中，可用CZE及MECC模式来分析。宗玉英等6用CZE及MECC分离了大黄中5种蒽醌类化合物，还测定了掌叶大黄、唐古特大黄和藏边大黄中的芦荟大黄素、大黄素和大黄酸。2.1.5 香豆素类（Coumarins）据文献报道7，以CZE分离模式可分离野菊花中7种香豆素类化合物，还分析测定了独活中9种香豆素类成分等。2.1.6 皂苷类（Saponin

8、s）药材中的皂苷类化合物不带电荷,一般采用MECC分离模式。岩上等8采用MECC分离了人参甲醇提取液中的7种人参皂苷Rbl、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg，重现性好。2.2 微乳液毛细管电泳技术在功能化中药指纹图谱中的应用微乳液毛细管电泳技术(MEEKC)作为常规毛细管电泳的补充，它的优势在于对于复杂组分的分离分析，特别是对于疏水性物质的增溶作用，使其在多组分分离分析中具有广阔的应用前景。2.2.1 药物分子与生物大分子的结合常数Kb颜磊9等利用MEEKC对天麻提取物与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用进行了动态的表达，对建立具有药物与生物大分子相互作用表达能力（Kb）的指纹图谱的方法进行

9、探索，建立表达相互作用的功能化指纹图谱，评价药物与受体的结合程度、强度，为筛选中药提取物中的活性成分提供了一种研究的思路。2.2.2 药物在不同pH值环境下的解离常数pKa陶然10等以模拟人体胃肠道内生物环境10mmol/L的磷酸缓冲液（pH分别为4.0、5.4、6.2、7.0、8.5、9.3）为MEEKC电泳行为的缓冲液，研究各种pH值状态下的pKa，得到刺五加提取物的不同电泳行为，并将刺五加提取物电泳行为的变化作为指纹图谱对其在机体消化道内的解离情况进行了阐述、并说明了其吸收状况。2.2.3 药物的油水分配系数logPow蒋雪梅11等利用MEEKC对女贞子中齐墩果酸的油水分配系数logPo

10、w进行研究，药物的logPow可用于预测其肠道吸收情况,一般认为logPow 为2 3 的药物在肠道中较易被吸收12。实验结果表明齐墩果酸的logPow为3.90，脂溶性较强,这与其不溶于水、略溶于氯仿的性质相符。同时推测齐墩果酸口服不易吸收, 从而为制备有效的齐墩果酸制剂提供了依据,可通过在齐墩果酸中添加适当的吸收促进剂、或制成相应的盐以提高溶解度,改善其在肠道的吸收。2.2.4 对药物功能团的筛选陶然13等在MEEKC分离分析条件下，利用大黄中-羟基蒽醌类物质与醋酸镁反应很可能生成了在电泳缓冲液中能稳定存在的产物。因此，在没有标准对照品以及提取物成分未知的情况下，便可实现对大黄中-羟基蒽醌

11、类物质的识别和筛选。3 毛细管电泳技术在功能化中药材指纹图谱中存在的问题与展望以CE为技术手段，针对目前中药质量控制存在的不足以及现行中药指纹图谱研究的局限性，提出了功能化中药指纹图谱的概念。以MEEKC测定药物的油水分配系数logPow14为例，首先，测定是基于药物在微乳液滴相和水连续相中的分配作用。若分析物不呈电中性，那么它除了存在分配作用之外，自身还具有有效淌度，其分离机理并不仅仅归因于分配的作用，在此情况下获得的logPow值是不准确的。因此，MEEKC测定中药logPow值的前提是：标准化合物及待测药物在所存在的溶液中保持电中性。但是，人体的生理环境可能使原本不带电荷的药物带上不同的

12、电荷，并非呈现简单的电中性状态。因此，研究荷电药物在细胞膜中的分配，了解其跨膜转运的过程及快慢，具有实际的研究意义。其次，历年来人们采用标记法得到微乳液的迁移时间tme值，但是采用标记tme需要用疏水性极强（完全不溶于水）的化合物作为乳液相标记物，以降低待测药物的浓度、进样量、以及高电场对其迁移行为的影响，但是不可能存在完全溶于微乳油相而不在水相中有任何分配的化合物。另外，也很难将这样的化合物溶于水相体积分数占多数的试样中，如果tme标记物在水相中有一点溶解，最后测得的药物的logPow值就会偏大。并且，微乳相标记物的疏水性较强，其出峰往往很慢，一般需要30min以上，使分离进程耗时。因此，对

13、现行MEEKC测定logPow所存在的问题，建立改进型微乳液毛细管电泳技术，对中药的活性成分、作用机制及药效作出准确的预测和评价，成为亟待解决的问题。参考文献1 喻录容.建立中药指纹图谱方法的研究现状J.华夏医学, 2004 ,17(4):645-647.2 陈静,林慧琼,邓小煌.毛细管电泳技术及其在药物分析中的应用J.广东药学院学报，2003,19(1):72.3 李琴韵,洪筱坤,王智华,等.高效毛细管电泳法测定吴茱萸中吴茱萸碱的含量J.药物分析杂志，2004,20(6):370.4 Liu YM et al. J Chromatogr，2003,639:3235 范国荣,胡晋红,李博华，等

14、.四倍体板蓝根中五种有机酸成分的毛细管电泳分离分析J.中国药科大学学报,2005, 31(2):111-1136 宗玉英.胶束电动毛细管色谱法分离和测定几种大黄含量J.药学学报,2005,30(8):5947 Ochocka R J,Rajzer D,Kowalski P,et al.Determination of coumarins from chrysanthemum segetum L by capillary electrophoresis.J Chromatogr A,2003,709:197-2018 陈晓峰,翟红林,李存红,等.毛细管电泳同时测定酚类系列化合物的表观离解常数J.兰州大学学报（ 自然科学版 ） , 2005 , 41(1):52-569 颜磊,熊彩侨,陶然，等.几种中药的毛细管电泳指纹图谱研究J.首届中国中西部地区色谱学术交流会论文集,中国,敦煌,2006:18310 陶然,蒋雪梅,曾礼娜，等.刺五加的微乳液毛细管电动色谱指纹图谱研究J,中成药,2007,29(1):3-611 蒋雪梅，颜磊,曾礼娜，等.女贞子的微乳液毛细管电动色谱指纹图谱研究