细胞工程制药复习

1、细胞融合单克隆抗体技术第一节 细胞融合一、细胞融合剂二、细胞融合方式三、细胞融合技术四、杂种细胞的筛选病病毒毒类类dna病毒：水痘和疱疹病毒病毒：水痘和疱疹病毒rna病毒：仙台病毒：仙台(hvj)病毒病毒rna致癌病毒：致癌病毒：rous肉瘤病毒肉瘤病毒冠状病毒冠状病毒化化合合物物水溶性：水溶性：peg、dmso脂溶性：溶血卵磷脂脂溶性：溶血卵磷脂生物生物制剂制剂昆虫提取物昆虫提取物受体作用电荷作用完整细胞之间的融合完整细胞之间的融合核体、胞质体与完整细胞的融合作用核体、胞质体与完整细胞的融合作用微小细胞与完整细胞的融合微小细胞与完整细胞的融合脂质体介导的细胞融合脂质体介导的细胞融合原理：原理

2、：促使细胞凝结促使细胞凝结（负电荷作用）（负电荷作用）破坏接触处细胞膜破坏接触处细胞膜（被洗脱）（被洗脱）n 分子量：分子量：4000400060006000n 浓度：浓度： 202060% 60% （通常：（通常：303050%50%）n phph： 偏碱为宜（偏碱为宜（ph7.4ph7.48.08.0）n 其他：其他： 二甲亚砜、植物血凝素二甲亚砜、植物血凝素n原理：原理：细胞在电场中极化成细胞在电场中极化成偶极子，并排列成串，偶极子，并排列成串，然后用高强度、短时然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞程的电脉冲击穿细胞膜。膜。甜菜原生质体电融合过程1）在高频电流电场下的相互接2）脉冲刺激后

3、30s3) 50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。n1）介质要求高n2）控制电压的强度和时间n融合率高 融合率（融合组多核细胞的核数对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）100n可在显微镜下定向诱导细胞融合n可直接挑选杂种细胞n原理：原理：n两种亲本细胞融两种亲本细胞融合混合物中可有合混合物中可有多种类型细胞，多种类型细胞，筛选目的是获得筛选目的是获得优良杂种细胞。优良杂种细胞。n同核体n异核体n多核体n异胞质体n核质体1 1）遗传互补筛选法遗传互补筛选法n 如如 亲本亲本1 1：叶绿体缺陷型叶绿体缺陷型 亲本亲本2 2： 光致死型光致死型 融合细胞：正常融

4、合细胞：正常n2 2）抗性互补筛选法抗性互补筛选法n如：如：亲本亲本1 1：放线菌素：放线菌素d d，msms 亲本亲本2 2：放线菌素：放线菌素d d，msmsn杂种细胞：放线菌素杂种细胞：放线菌素d d，msmsn而亲本和其它细胞死亡而亲本和其它细胞死亡3 3）利用物理特性筛选法利用物理特性筛选法 亲本亲本1 1：异硫氰酸荧光素（：异硫氰酸荧光素（fitcfitc）标记）标记 亲本亲本2 2：碱性蕊香红荧光素标记：碱性蕊香红荧光素标记 荧光显微镜下，亲本荧光显微镜下，亲本1 1：绿色，亲本：绿色，亲本2 2：红色，杂种细胞可以区分红色，杂种细胞可以区分n4 4）利用生长特性筛选法利用生长特

5、性筛选法n如粉兰烟草与朗氏烟草细胞：外源激素如粉兰烟草与朗氏烟草细胞：外源激素n融合细胞：内源激素融合细胞：内源激素n1 1）利用抗药性筛选系统利用抗药性筛选系统n亲本亲本a a：ampamp，kankann亲本亲本b b：kankan，ampampn杂种细胞：杂种细胞： ampamp ，kankann2 2）营养互补筛选系统营养互补筛选系统n亲本亲本a a：色氨酸缺陷型：色氨酸缺陷型n亲本亲本b b：苏氨酸缺陷型：苏氨酸缺陷型n杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，亲本细胞均死亡。的培养基上培养，亲本细胞均死亡。n3 3）温度敏感突变型温度敏感突变型

6、 n亲本一：亲本一：kankan，3737度度n亲本二：高温敏感突变型，亲本二：高温敏感突变型，kankann杂种细胞能在高温和含杂种细胞能在高温和含kankan培养基生长。培养基生长。一、抗体的结构与功能一、抗体的结构与功能二、单克隆抗体的制备和生产二、单克隆抗体的制备和生产三、单克隆抗体的改造和应用三、单克隆抗体的改造和应用单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单抗的特点单抗的特点n1.1.高度特异性高度特异性n2.2.高度稳定性高度稳定性n3.3.高抗体活性高抗体活性n4.4.不可知性不可知性n5.5.过于单一性过于单一性单抗的制备原理单抗的制备原理n1.1.病毒转化病毒转化n2.2.细胞杂交

7、细胞杂交单抗的制备过程单抗的制备过程n1.1.动物免疫与亲本选择动物免疫与亲本选择n2.2.细胞融合细胞融合n3.3.杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选n4.4.单抗制备和冻存单抗制备和冻存n5.5.单抗纯化单抗纯化1.1.动物免疫与亲本选择动物免疫与亲本选择n1 1）骨髓瘤细胞）骨髓瘤细胞n一般不分泌抗体一般不分泌抗体n能在体外无限繁殖和连续继代培养能在体外无限繁殖和连续继代培养n为为hprthprt或或tktk。n多用多用balb/c balb/c 小鼠的骨髓瘤细胞。小鼠的骨髓瘤细胞。n2 2）淋巴细胞）淋巴细胞免疫方法免疫方法n体内法体内法n体外法体外法2.细胞融合细胞融合n脾细胞和骨髓细

8、胞混匀脾细胞和骨髓细胞混匀n离心离心n沉淀滴加沉淀滴加50%50%的的peg 0.5mlpeg 0.5mln静置静置9090秒秒n滴加不含血清培液或滴加不含血清培液或bss 5bss 510ml10mln静置静置1010分钟分钟3.hat3.hat培养基筛选杂交瘤细胞培养基筛选杂交瘤细胞n细胞团块分散，加细胞团块分散，加hathat溶液溶液，稀释，稀释n加入有饲细胞的多孔培养板加入有饲细胞的多孔培养板n2 23 3天半量换液，天半量换液，7 7天后完成天后完成细胞融合的选择示意图1 1）hathat选择系统选择系统nhathat：是含一定浓度：是含一定浓度次黄嘌呤（次黄嘌呤（h h）、氨基喋呤

9、氨基喋呤（a a）及及胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（t t）的一种的一种选择性培养选择性培养基基，其中三种成分与细胞，其中三种成分与细胞dnadna合成有关。合成有关。ndnadna合成途径有两种。合成途径有两种。n原理：原理：n杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷移酶缺陷（hprthprt- -）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（tktk- -）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞为亲本之一，为亲本之一，无补救途径无补救途径。n含氨基喋呤培养基抑制了全合成途径含氨基喋呤培养基抑制了全合成途径。n淋巴细胞具有淋巴细胞具有合成合成dnad

10、na的的两条途径两条途径。n杂种细胞通过互补作用获得杂种细胞通过互补作用获得hrpthrpt或或tktk基因基因，可应用，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成通过补救合成途径合成途径合成dnadna。n在在hathat培养基中，培养基中，hprthprt- - 或或tktk- - 亲本细胞死亡，淋巴亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活只有杂种细胞存活。2）特异性杂交瘤细胞的筛选）特异性杂交瘤细胞的筛选n可溶性抗原可溶性抗原: :放射免疫、免疫酶标测定等放射免疫、免疫酶标测定等n细胞抗原细胞抗原: :免疫荧光、被动血凝实

11、验、补体免疫荧光、被动血凝实验、补体依赖的细胞毒等依赖的细胞毒等利用培养基对单抗进行鉴定的过程一种制备人肿瘤单克隆抗体的方案n方法有方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、流式细胞仪操作法、流式细胞仪等。等。n通过适当的稀释达到分离通过适当的稀释达到分离单个细胞单个细胞进行培养的目的进行培养的目的n1 1）取出阳性孔内的细胞进行计数）取出阳性孔内的细胞进行计数n2 2）用培液将其稀释到例如每毫升内）用培液将其稀释到例如每毫升内1010个细胞。个细胞。n3 3）如果在）如果在9696孔板内每孔加孔板内每孔加0.1ml0.1ml，其机率将为每孔，其机率将为每孔内落

12、入一个细胞。内落入一个细胞。n4 4）加入一定数量的饲养细胞，经过）加入一定数量的饲养细胞，经过8 8 1212天后，可观天后，可观察到有集落生长的孔。察到有集落生长的孔。n5 5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。n在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层层0.50.5的琼脂，待凝固后再铺上一层的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的混有杂交瘤细胞的0.250.25的软琼脂。的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的种于含饲养细胞的9696孔板内。孔板内。n1 1）诱生腹水（动物生

13、物反应器）诱生腹水（动物生物反应器）n2 2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维系统等进行系统等进行大规模培养（人工生物反应器）大规模培养（人工生物反应器）n单抗作为体内体外单抗作为体内体外诊断试剂诊断试剂在临床生在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等定位等n单克隆抗体单克隆抗体靶向制剂靶向制剂，治疗癌症等疾，治疗癌症等疾病病n杂交人鼠单克隆抗体杂交人鼠单克隆抗体n现在已经有各种不同类型的单抗试剂合在现在已经有各种不同类型的单抗试剂合在市场出售，例如乙型肝炎的表面抗原，铁市场出售，例如乙型肝炎的表面抗原，铁蛋白、促绒毛

14、膜性激素、促甲状腺激素、蛋白、促绒毛膜性激素、促甲状腺激素、癌症、艾滋病等诊断试剂。癌症、艾滋病等诊断试剂。n用用同位素标记的单抗同位素标记的单抗在特定的组织中成象在特定的组织中成象的技术可以用于肿瘤、心血管畸形的的技术可以用于肿瘤、心血管畸形的体内体内诊断诊断。n1 1）药物与单抗）药物与单抗直接偶联直接偶联n通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基之间直接形成稳定的酰胺键。基之间直接形成稳定的酰胺键。n利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。n利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱，利用羰基与抗体分子的

15、氨基反应形成西佛氏碱，最后还原。最后还原。n这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一定的选择性。定的选择性。n如：如：1 1，4 4溴柔红霉素溴柔红霉素n2 2）药物）药物通过小分子通过小分子与单抗连接与单抗连接n通过一些小通过一些小分子交联剂分子交联剂，把药物分子上的，把药物分子上的某些基团连接起来。某些基团连接起来。n小分子交联剂：如小分子交联剂：如同型双功能试剂同型双功能试剂，包括，包括戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐；戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐；异型双功能试剂异型双功能试剂：n n琥珀酰胺基琥珀酰胺基3 3丙丙酸和寡肽等。酸和寡

16、肽等。n顺乌头酸酐制成的最常用顺乌头酸酐制成的最常用n3 3）药物通过）药物通过大分子大分子与抗体相连与抗体相连n大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。n总之，利用单抗试剂合可以作为靶向总之，利用单抗试剂合可以作为靶向药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、各种病原体病等。各种病原体病等。2、杂交人鼠单克隆抗体、杂交人鼠单克隆抗体n鼠源抗体一般无法有效地激鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统，还发宿主的免疫防卫系统，还可能引发人对鼠源抗体本身可能引发人对鼠源抗体

17、本身的免疫反应。的免疫反应。nfcfc片段片段n利用人源的利用人源的fcfc区域的区域的dnadna片片段替换鼠源单抗的段替换鼠源单抗的fcfc的的dnadna片段。片段。 n嵌合抗体可以保留其目标专嵌合抗体可以保留其目标专一性，降低人的抗鼠反应。一性，降低人的抗鼠反应。n方法方法1 1：分离人：分离人b b细胞，使之与荧光标记的抗细胞，使之与荧光标记的抗原相结合，通过荧光标记选择能产生特殊抗原相结合，通过荧光标记选择能产生特殊抗体的体的b b细胞，并用细胞，并用epsteinepsteinbarrbarr病毒转化，病毒转化，得到少量的单抗。得到少量的单抗。n方法方法2 2：将人源免疫干细胞导

18、入缺失大部分免：将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内，遇到抗原时，产生人源疫细胞的小鼠体内，遇到抗原时，产生人源的抗体。的抗体。n方法方法3 3：将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎：将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎中，能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠中，能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠n将抗体的可变区与一非抗体蛋白将抗体的可变区与一非抗体蛋白融合起来，使融合蛋白继承有抗融合起来，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。可以保留体分子的结合特异性。可以保留不同程度的不同程度的抗体结合特异性抗体结合特异性和和激激发其他免疫反应的能力发其他免疫反应的能力。5 5、抗体酶、抗体酶n一种对酶促反应过渡态特异的抗体结合了酶与抗体一种对酶促反应过渡态特异的抗体结合了酶与抗体的优点，既可以起的优点，既可以起酶促催化作用酶促催化作用，又可以，又可以起抗体的起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用选择性和专一性结合抗原的作用。n在大肠杆菌的系统中，可以表达在大肠杆菌的系统中，可以表达vlvl衔接物衔接物vhvh的序列，产生单链抗体。的序列，产生单链抗体。n单链单链f fv v片段片段: :抗体体积小、免疫原性较低，渗透性抗体体积小、免疫原性较低，渗透性好，用于实体肿瘤的诊断和治疗。好，用于实体肿瘤的诊断和治疗。n生物导