脉管系统寄生虫的病原检查方法

1、脉管系统寄生虫的病原检查方法来源：检验医学专题网 更新：2013-8-29 医学检验网脉管系统寄生虫的病原检查方法:由于脉管系统内寄生虫的寄生部位及离体途径的不同，决定了病原学检查方法的不同。弓形虫滋养体速殖子阶段也可寄生在血液的有核细胞内。本章主要介绍丝虫、血吸虫、疟原虫、利什曼原虫、锥虫及巴贝虫的病原学检查。有关免疫学及分子生物学检查方法见其它网页。一、血膜染色法血液检查是诊断疟疾、丝虫病、巴贝虫病和锥虫病的基本方法。从指尖或耳垂取血，婴儿可于足部取血。先用75酒精棉球擦拭取血部位， 待干后持采血针迅速刺由于脉管系统内寄生虫的寄生部位及离体途径的不同，决定了病原学检查方

2、法的不同。弓形虫滋养体速殖子阶段也可寄生在血液的有核细胞内。本章主要介绍丝虫、血吸虫、疟原虫、利什曼原虫、锥虫及巴贝虫的病原学检查。有关免疫学及分子生物学检查方法见其它网页。一、血膜染色法血液检查是诊断疟疾、丝虫病、巴贝虫病和锥虫病的基本方法。从指尖或耳垂取血，婴儿可于足部取血。先用75酒精棉球擦拭取血部位， 待干后持采血针迅速刺入皮肤12 mm 深， 挤出血滴涂片。间日疟宜在发作后数小时采血；恶性疟在发作初期采血可见大量环状体，1 周后可见配子体。丝虫成虫寄生于淋巴系统，但产出的微丝蚴主要在血循环中，且具有夜现周期性，故采血应在晚9 时至次晨2时之间进行为宜。1血膜制片疟原虫检查多用薄血膜或

3、厚血膜法，前者取血量少，涂面大，疟原虫分散，但虫体形态结构清晰，易于作虫种鉴别；后者取血量较多，红细胞较集中，在疟原虫数量较少时便于发现，但因制片时血细胞相互堆积挤压，疟原虫皱缩变形， 缺乏经验者较难辨认。故最好在同一张载玻片上同时做厚、薄血膜（如下图)，以便比较观察。血液涂片的制作（1) 薄血膜制片：在载玻片13 与医师招聘23 交界处蘸血一小滴（约2l)，以一端缘光滑的载片为推片，将推片一端置于血滴之前，并与载片形成3045 度的夹角， 待血液沿推片端缘扩散时，均匀而迅速适当地用力向前推成薄血膜。血量不宜太多或太少，两玻片间的夹角要适当，否则血膜会过厚或过薄。推片时用力要均匀，一次推成，切

4、勿中途停顿或重复推片。理想的薄血膜，应是血细胞分布均匀，无裂缝，整个血膜呈舌形。（2) 厚血膜制片：于载玻片的另一端13 处蘸血一滴（约3l)，以推片的一角，将血滴自内向外作螺旋形摊开，使之成为直径约1cm 的厚血膜。厚血膜为多层血细胞的重叠，约等于20 倍薄血膜的厚度。过厚则血膜易脱落， 过薄则达不到浓集虫体的目的。将厚、薄两种血膜涂在同一张载玻片上，方法是将载玻片分成六等份，将厚血膜涂在第三格的中央，薄血膜涂在第四格前缘至第六格中部，一、二格备贴标签及编号用。厚、薄血膜需用蜡笔划线分开，以免厚血膜溶血时影响薄血膜或薄血膜用甲醇固定时影响厚血膜。检查微丝蚴时，需取血3 大滴，（相当于60 m

5、m3)，涂成直径约1520cm 的圆形或25cm×15cm 长方形厚血膜。血片充分晾干，用甲醇或无水酒精固定薄血膜。如薄、厚血膜在同一玻片上，切勿将固定液流到厚血膜上。厚血膜上滴加蒸溜水进行溶血，待血膜呈灰白色时， 将水倒去，晾干后再用甲醇固定。2染色（1) 姬氏染色法（Giemsa stain)： 此法染色效果良好，血膜褪色较慢，保存时间较久，染色技术也易掌握，适用于染大批量血片标本。染液配制：姬氏染剂粉1g，甲醇50 ml，纯甘油50 ml 。将姬氏染剂粉置于研钵中，加小量甘油充分研磨，加甘油再磨， 直至50 ml 甘油加完为止，倒入棕色瓶中。然后分几次用少量甲醇冲洗钵中甘油染粉

6、，倒入玻瓶直至50 ml 甲醇用完为止， 塞紧瓶口，充分摇匀，置65温箱内24 小时或室温阴暗处12 周后过滤，备用。染色方法：用pH6870 的缓冲液，将姬氏染液稀释，比例约为1520 份缓冲液加一份姬氏染液。用蜡笔划出染色范围，将稀释的姬氏染液滴于已固定的薄、厚血膜上，染色半小时（室温)，再用上述缓冲液冲洗。血片晾干后镜检。（2) 快速姬氏染色法：姬氏染液1 ml，加缓冲液5 ml，如前法染色5 分钟后用缓冲液冲洗，晾干后镜检。（3) 瑞氏染色法（W rights stain)：此法操作简便，适用于临床诊断，但甲醇蒸发甚快，掌握不当易在血片上发生染液沉淀，并较易褪色，保存时间不长，多用于临

7、时性检验。染液配制：瑞氏染剂粉0105g，甲醇97 ml，甘油3 ml 。将瑞氏染剂粉加入甘油中充分研磨，然后加少量甲醇，研磨后倒入瓶内，再分几次用甲醇冲洗钵中的甘油溶液，倒入瓶内直至用完为止。摇匀， 24 小时后过滤待用。染色方法：瑞氏染剂含甲醇，薄血膜不需先固定；厚血膜则需先经溶血，待血膜干后才能染色。染色前先将溶过血的厚血膜和薄血膜一起用蜡笔划好染色范围，以防滴加染液时外溢。滴染液使覆盖全部厚、薄血膜，30 秒至1 分钟后加等量蒸馏水， 轻轻摇动载玻片，使蒸馏水和染液混合均匀，此时出现一层灿铜色浮膜， 约35 分钟后用水缓慢从玻片一端冲洗（注意勿先倒去染液或直对血膜冲洗)，至血

8、膜呈现紫灰色为止，晾干后镜检。在镜检薄血膜过程中，有时遇见与医师招聘网疟原虫类似的物体，应加以区别。如单个血小板附着于红细胞上，易误认为环状体或发育中的滋养体。成堆的血小板易误认为成熟裂殖体。血小板中央部常呈紫红色颗粒状结构，周边部分着色浅，但不如疟原虫紫红色的胞核与浅蓝色的胞质分得清楚。此外还有染液沉淀颗粒以及偶有细菌、霉菌、尘粒、白细胞碎片重迭于红细胞上，很象环状体或滋养体。但这些类似物大多呈一种颜色，如细调显微镜焦距，可以看出它们与红细胞不在同一水平面上。特别注意疟原虫与巴贝虫的鉴别。厚血膜经溶血后，红细胞轮廓已消失，疟原虫皱缩变形， 虫体比薄血膜中的略小；有的疟原虫胞质着色很深，胞核模

9、糊不清，初学者较难识别。检验人员必须经过一段时间的严格训练，在充分掌握薄血膜中各种疟原虫的形态特征后，才能认清厚血膜中的疟原虫。当厚、薄血膜涂在同一片上时，应先检查厚血膜，发现疟原虫后如鉴定虫种有困难，可再仔细观察薄血膜，以节约时间，提高镜检率。在低倍镜下，微丝蚴为细长、无色透明、头端钝圆、尾端尖细、呈不同弯曲的虫体。注意在血膜上有时留有棉纤维，状似微丝蚴，应加以鉴别。棉纤维的长短粗细不等，两端多呈折断状，内部常见纵行条纹。血膜染色法是诊断丝虫病最常用的方法，不仅可以避免漏检，还可鉴别虫种和定量计数微丝蚴。另外也可用离心浓集法以提高检出率，常用于门诊，但操作复杂，且需静脉采血，不宜用于普查。海

10、群生白天诱出法可用于夜间取血不方便时，但对低密度感染患者易漏诊。二、溶血离心沉淀法溶血离心沉淀法又称浓集湿血片染色法，不需特殊仪器设备，是基层医院快速、准确地诊断疟疾的良好方法。将离心管内加入210000 的白皂素蒸馏水溶液1 ml， 取受检者耳垂血一大滴入该试管内，混匀后常规离心5 分钟，吸去上清液，底部沉渣摇匀。取一滴于干净载玻片上，再用直径为1520 mm 的铁丝棒依次蘸取04 的伊红液和吉氏原液，先后于该载玻片上液体混匀， 然后覆以22 mm×22 mm 盖片，即可在油镜下检查，镜检10 分钟查不见疟原虫者为阴性。经该法处理后的标本，白皂素液破坏了大部分正常的红细胞，少量未被

11、破坏的红细胞边缘紫色呈锯齿状。感染疟原虫的红细胞对染料的吸附力较正常红细胞为强，除少数感染小滋养体期的红细胞发生变形外，其它含各期疟原虫的红细胞皆不变形，且着色较深，疟原虫胞浆染为深兰色，核为紫红色，疟色素为褐色，在镜下较易识别。由于白皂素破坏了正常的红细胞，离心又使疟原虫浓集于试管底部，使单位面积内含虫数量增多，从而提高了检出率。但在操作时，试管内白皂素与血液混合后放置时间及离心时间都不宜过长，否则会出现絮状物，影响检查结果。三、尼龙绢筛集卵法此法是诊断慢性血吸虫病的首选方法，可显著提高检出率。取3050g 粪便，置于杯内，用少量水将粪便搅匀，经粗筛过滤后的粪液， 用两个重叠的尼龙筛（120

12、 目在上，200 目在下) 收集，用一定压力的自来水边洗边筛，直至流水变清为止，继而将留有粪液的200 目尼龙筛浸泡在20NaO H 溶液中消化10 分钟，自来水冲洗去掉细渣，吸取筛内粪渣镜检虫卵。应特别注意的是尼龙筛在使用前后均应经来苏液浸泡，自来水冲洗干净，避免虫卵嵌在筛孔中造成交叉污染。此外，筛孔的孔径若被破坏可显著影响检出率。四、毛蚴孵化法毛蚴孵化法（miracidiu m hatchingmethod) 是依据血吸虫卵内毛蚴在适宜温度的水中，短时间内可孵出的特性而设计，适用于早期血吸虫病患者的粪便检查。其特点是将沉淀法和孵化法结合进行，可提高检出率。取粪便约30g， 先经重力沉淀法处

13、理，将粪便沉渣倒入三角烧瓶内，加清水（凉开水) 至瓶口，在2030的条件下， 经46 小时后用肉眼或放大镜观察结果。可见水面下呈白色点状物作直线游动的毛蚴。必要时可用吸管吸出白色点状物镜检。如无毛蚴，每隔46 小时（24 小时内) 观察一次。气温高时，毛蚴在短时间内孵出，故在夏季要用12食盐水或冰水冲洗粪便， 最后一次改用室温清水。 五、直肠活组织检查法慢性及晚期血吸虫病人肠壁组织增厚，虫卵排出受阻，故粪便中不易查获虫卵，可做直肠活组织检查。用直肠镜钳取直肠粘膜组织，做切片或置于两块载玻片间压薄，镜检虫卵。可仔细区分活卵、变性卵和死卵。活卵椭圆形，淡黄色，卵壳薄而边缘整齐，内含毛蚴或

14、卵黄细胞及胚细胞；死卵呈黑灰色，卵壳增厚和边缘不清，卵内毛蚴成团块状，卵黄细胞和胚细胞分解成大量的碎片或颗粒；虫卵死亡后形态变化不明显的称为近期变性卵，形态变化明显的称为远期变性卵。对未治疗病人检出的虫卵，不论死活均有参考价值；对有治疗史的病人，如有活卵或近期变性卵，表明受检者体内有成虫寄生；若为远期变性卵或死卵，则提示受检者曾经有过血吸虫感染。目前流行区血吸虫病人大多经过一次或多次治疗，检查到活卵的病例较少，并且此方法有一定的创伤性，故应慎用。六、穿刺涂片染色法主要用于检查利什曼原虫无鞭毛体，也可查到锥虫。1骨髓穿刺一般常作髂骨穿刺，嘱患者侧卧， 暴露髂骨部位。视年龄大小， 选用1720 号

15、带有针芯的干燥无菌穿刺针，从骸骨前上棘后约1cm 处刺入皮下，当针尖触及骨面时，再慢慢地钻入骨内约0510cm，即可拔出针芯，接2 ml 干燥注射器，抽取骨髓液。取少许骨髓液作涂片甲醇固定，同薄血膜染色法染色，油镜检查。2淋巴结穿刺检出率低于骨髓穿刺，但方法简便、安全。对于以往治疗的患者，因其淋巴结内原虫消失较慢，故仍有一定诊断价值。穿刺部位一般选腹股沟部，先将局部皮肤消毒，用左手拇指和食指捏住一个较大的淋巴结，右手用一干燥无菌6 号针头刺入淋巴结。稍待片刻，拔出针头，将针头内淋巴结组织液滴于载玻片上，做涂片染色检查。3皮肤活组织检查利什曼原虫在皮肤上出现丘疹和结节等疑似皮肤型黑热病患者，可选

16、择皮损较明显之处，作局部消毒，用干燥灭菌的注射器，刺破皮损处，抽取组织液做涂片；或用消毒的锋利小剪，从皮损表面剪取一小片皮肤组织，以切面做涂片；也可用无菌解剖刀切一小口，刮取皮肤组织做涂片。以上涂片均用瑞氏或姬氏染液染色。如涂片未见原虫，可割取小丘疹或结节，作组织切片染色检查。七、原虫培养法1前鞭毛体培养常用3N 培养基（N0vyMacNealNicolle cultue medium)。（1)培养基制备：14g 琼脂、06g 氯化钠加入90 ml 双蒸水，加热溶解后每35 ml分装入培养管中，用棉塞塞紧管口，12115 min 灭菌， 待冷却至48时每管加入培养基13 量的去纤维素

17、蛋白的兔血清，混匀后斜置冷却成斜面。每管加入洛克液0203 ml，置37温箱中培育24 小时，证明无菌后即可应用，接种前加青霉素和链霉素。（2)操作步骤：取皮肤或组织、骨髓标本加入培养管中，2225 温箱中培养。每23 天取少量培养液镜检或染色镜检， 一旦发现有前鞭毛体则应立即取数滴培养液转入新鲜培养基。若为阴性，应转种培养1 个月再报告结果。2无鞭毛体培养利什曼原虫的无鞭毛体寄生在哺乳动物的单核吞噬细胞内，也可以体外培养在这类细胞内，例如可在巨噬细胞培养株J774 G8 内培养或在直接从外周血分离的单核细胞内培养。前者巨噬细胞分裂，且虫体大量增殖，但有时会混有前鞭毛体。后者则适用于短期实验，虽然虫体自身增殖，但巨噬细胞并不分裂。无鞭毛体还可以生长在无细胞的培养基中。这种无鞭毛体可以被巨噬细胞迅速吞噬，并在细胞内分裂，可转化为前鞭毛体。一般培养温度为33，每96 小时转种一次。3疟原虫培养四种人体疟原虫的红内期， 仅恶性疟原虫可以成功地在体外长期培养。但操作复杂，需要人的“O” 型血红细胞、人血清及由3氧气、4二氧化碳和93氮气组成的气体充在培养瓶内。当然还需要基本的培养液例如RPMI1640 等。八、动物接种法1利什曼原虫取可疑利什曼患者骨髓或淋巴结穿刺液或皮肤刮取物，加适量生理盐水稀释后，取05 ml 注入中华仓鼠等动物腹腔内，34 周后解剖动物，