西格列汀联合吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏TIMP-1、TGF-β1

1、西格列汀联合吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏TIMP-1、TGF-1表达的影响熊盛池1，谢 燕作者介绍：熊盛池（1974-），男，主治医师，硕士， 研究方向：糖尿病防治研究。通讯作者：谢 燕，女，主任医师，E-mail:xieyanyouxiang，熊 利2（1.四川省凉山州第一人民医院内分泌科，西昌 615000； 2. 四川省喜德县两河口中心卫生院内科，西昌 615000）【摘要】目的:研究西格列汀联合吡格列酮对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。方法：建立STZ（链脲佐菌素）诱导的糖尿病（Diabetes MellitusDM）SD大鼠模型，将造模成功的DM大鼠随机抽样分成以下4个组：西格列汀组、

2、模型组、西格列汀+吡格列酮组、吡格列酮组，并另设正常组以作对照。对每一组大鼠给予相应的措施干预处理12周。光镜观察肾组织病理结构改变；免疫组织化学法检测肾组织TIMP-1和TGF-1表达。结果：模型组肾组织病理结构改变明显，肾皮质TIMP-1和TGF-1表达显著升高；西格列汀组、西格列汀+吡格列酮组和吡格列酮组肾组织TIMP-1和TGF-1等指标显著低于模型组(P<0.05)，以西格列汀+吡格列酮组最为明显(P<0.01)。结论：西格列汀对DM大鼠的肾脏具有保护作用，而与吡格列酮联用效果更佳。其保护机制与TIMP-1和TGF-1的在肾组织的表达减少有关。【关键词】西格列汀；糖尿病肾

3、病；基质金属蛋白酶组织抑制因子1；转化生长因子1.【中图分类号】R587.1 【文献标识码】A 【收稿日期】2012-06-29Effects of Sitagliptin on the expression of TIMP-1 and TGF-1 on kidney of diabetic Rats. Xiong Sheng-chi, et al（Department of endocrinology, First Hospital of Liang Shan，615000 China ）【Abstract】Objective: To study the protective effects

4、 of the Sitagliptin on the kidney of diabetic rats.Methods:The model of DM rats induced by STZ were randomly divided into the following four groups: Sitagliptin group, diabetic model group, Sitagliptin combined with pioglitazone groupe , Pioglitazone group and normal control group. For each group of

5、 rats were respectively intervened for 12 weeks by the corresponding measures . and renal histopathological change was observation by Light microscopic. TIMP-1.TGF-1 in renal tissue was detected by immunohistochemical technique. Results: The renal tissue histopathological of diabetic model group was

6、 markedly different from others group. The expression of TIMP-1 and TGF-1 on renal cortex was increased in diabetic rats model group than others, Conclusion: Sitagliptin can protect the kidney from diabetic rats injury. And the protective effects of Sitagliptin combined with pioglitazone group is th

7、e most pronounced in all group .The protective mechanism in the kidney of Sitagliptin combined with pioglitazone may be associated with reduction the expression of TIMP-1 and TGF-1 in renal tissue. 【Key words】 Sitagliptin; Diabetic nephropathy; Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-1;transfo

8、rming growth factor 1. 西格列汀（sitagliptin）为二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4 ,DPP-4）抑制剂，DPP-4抑制剂是近年来上市的一类全新的突破性创新口服降糖药物，它能够提高一种被称为“肠促胰岛激素”:胰升血糖素样肽-1（GLP-1）和肠抑胃肽（GIP）1的生理机制。GLP-1和GIP可促进细胞葡萄糖依赖性地释放胰岛素，即此种促进胰岛素释放的作用在血糖水平升高时非常明显，而当血糖水平恢复正常时则消失2。DPP-4抑制剂的主要作用在于减少GLP-1的降解，延长其活性，使之持续分泌胰岛素，并减少肝脏葡萄糖的合成，从而控制糖尿病患者的

9、血糖水平，延缓或阻止糖尿病肾病的发生。而吡格列酮为噻唑烷二酮类降糖药，能选择性的激动PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体) 。具有降糖、调脂、抗炎、调节细胞生长因子、减少尿蛋白、改善胰岛素的敏感性等重要作用。本文以西格列汀联合吡格列酮干预糖尿病大鼠（Diabetic Mellitus,DM）肾脏TIMP1、TGF-1的表达，以观察其对糖尿病大鼠肾脏保护的作用机制，为临床对糖尿病肾病的治疗提出良好的参考资料。1 材料与方法1.1材料1.1.1 动物 6-8周龄体重180-200g的健康雄性SD清洁级大鼠70只，全部购自重庆医科大学动物实验中心，许可证号SYXK（渝）2004008。1.1.2 试

10、剂 西格列汀，江苏先声药业有限公司惠赠（批号：国药准字H20090834）；吡格列酮，北京太阳药业有限公司惠赠（批号：国药准字H20040267）；TIMP-1试剂盒，购自北京中杉生物技术有限公司；TGF-1试剂盒,购自北京中杉生物技术有限公司。1.2 方法1.2.1 动物模型的制备 按参考文献3稍加修改建立模型。取SD大鼠60只禁食12h后，按60 mg/kg左下腹腔注射STZ，制造DM大鼠模型。实验期间给予足够的饮水，造模4小时后腹腔注射20%的葡萄糖3-5ml，避免低血糖死亡，72 h后大鼠尾尖取血测空腹血糖，血糖16.0 mmol/L确定为DM成模大鼠，血糖20.0 mmol/L给予诺

11、和灵N2-3 U皮下注射，以防糖尿病酮症酸中毒死亡。将成模大鼠随机抽样分成4组：西格列汀组、模型组、吡格列酮组、西格列汀+吡格列酮组各14只。同时取10只正常大鼠作为正常对照，腹腔注射等剂量无菌柠檬酸钠缓冲液，后在尾尖取血测血糖，血糖均在4.08.0 mmol/L。上述方法7 d后，西格列汀组按50 mg/kg.d配予3-5 ml蒸馏水灌胃；西格列汀+吡格列酮组分别按50 mg/kg.d和15 mg/kg.d配以同等量蒸馏水灌胃；吡格列酮组按15 mg/kg.d配以同等量蒸馏水灌胃，每日早晨8点-9点灌胃1次，模型组和正常对照组大鼠每日同一时间给予等量蒸馏水灌胃。对血糖20.0 mmol/L可

12、能危及生存的大鼠皮下注射诺和灵N 2-3U。大鼠自由饮水、进食，室温1820，湿度60-70，上述方法喂养12 周。1.2.2 取材与固定 所有大鼠在喂养12周后空腹称重量，以3水合氯醛腹腔注射(10 mlkg)进行麻醉，腹主动脉取血以备行肾功能等生化检查，后剖腹分离双侧肾脏，每侧肾脏各取1/2肾组织放入4%多聚甲醛液固定保存24h，后脱水，石蜡包埋，切片，每片厚5 um，行苏木精-伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ,HE)和免疫组织化学检测1.2.3 主要观察指标 （1）一般情况观察；（2）肾脏病理检查：处死大鼠时，肉眼观察肾脏外观情况，肾组织行HE染色；

13、（3）肾组织TIMP-1，TGF-1免疫组化染色(三步法)；1.2.4 统计学方法 应用SPSS11.0统计分析软件处理，数据结果以均数±标准差（±s ）表示，计量资料采用单因素方差分析,两组间比较用t检验。2 结 果2.1 一般情况观察成模大鼠均出现多尿、烦渴、多饮、体重减轻等糖尿病表现，部分大鼠有视力下降、皮肤溃疡和感染并发症。模型组症状及并发症最明显，实验期间有4只死亡；正常组无死亡大鼠，其余各组症状轻微，实验期间仅有2 只死亡，西格列汀+吡格列酮组和西格列汀组各1只。2.2 各组大鼠肾脏组织病理学的特点HE染色见，模型组大鼠肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜区有基底膜基

14、质沉积，出现毛细血管襻折叠和融合，毛细血管阻塞。西格列汀组、西格列汀+吡格列酮组和吡格列酮组仅有毛细管基底膜增厚，系膜区有基底膜基质沉积，且明显轻于模型组。正常对照组大鼠肾组织结构无明显异常。（见图1）。2.3 各组大鼠TIMP-1的表达TIMP-1阳性染色主要位于肾小球毛细血管基底膜、系膜区、肾小管基底膜及毛细血管襻处。正常对照组大鼠肾小球毛细血管基底膜、系膜区、肾小管基底膜上皮细胞及毛细血管襻处仅有微弱表达；定量分析显示，模型组TIMP-1上述部位表达显著多于正常对照组(P<0.05)；西格列汀组、西格列汀+吡格列酮组和吡格列酮组TIMP-1表达显著少于模型组(P<0.05)；

15、西格列汀+吡格列酮组表达减少较西格列汀组和吡格列酮组更为明显(P<0.01)，不过上述部位表达均多于正常对照组；西格列汀组与吡格列酮组之间差异无统计学意义(P>0.05)（表1）。2.4 各组大鼠TGF-1表达 糖尿病大鼠与正常对照组大鼠比较，前者肾小球脏层上皮细胞、毛细血管基底膜及系膜区肾小球上皮细胞、肾小管基底膜及及毛细血管襻TGF-1均有明显表达，后者TGF-1主要在肾小球脏层上皮细胞、毛细血管基底膜及系膜区有微弱表达。定量分析显示，模型组TGF-1表达显著多于正常对照组(P<0.05)，西格列汀+吡格列酮组、西格列汀组和吡格列酮组TGF-1表达显著少于模型组(P<

16、;0.05)，西格列汀+吡格列酮组表达减少较西格列汀组和吡格列酮组更为明显(P<0.01)，西格列汀+吡格列酮组TGF-1表达显著少于西格列汀组和吡格列酮组(P<0.05)，不过上述部位表达任然多于正常对照组；西格列汀+吡格列酮组与西格列汀组TGF-1表达无明显差异(P>0.05)，（表1） 。表1 12w后各组大鼠肾TIMP-1和TGF-1的表达（±s）组别n肾TIMP-1肾TGF-1正常对照组100.072±0.016#0.057±0.016#模型组110.201±0.013 * 0.195±0.016 *西格列汀组120

17、.138±0.014 & 0.128±0.020 &吡格列酮组12 0.142±0.022 0.129±0.021西格列汀+吡格列酮组120.108±0.015 0.112±0.015 注：与正常对照组比较#p<0.05；与模型组比较*p<0.01；与西格列汀比较&p<0.05；与吡格列酮组比较p<0.053 讨 论TGF-1是促纤维化最重要的因子之一，通过刺激细胞外基质的产生4，抑制蛋白酶和胶原酶，减少基质的降解，使细胞外基质在肾脏大量沉积，进一步发展为肾组织纤维化。肾纤维化是细胞外基

18、质过度沉积所致，但胶原的降解减少也是重要原因。细胞外基质由基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制因子TIMPs调节，前者的作用是降解胶原，而后者的作用恰恰是对抗MMPs，导致胶原的降解减少，所以增加MMPs或减少TIMP-1在肾组织的表达，均可使细胞外基质减少。因此TIMP-1对肾纤维化的形成有不容忽视的重要地位5。2型糖尿病的发生与胰岛素抵抗和胰岛-细胞功能紊乱有关。解决这些问题需要采用不同的方式进行联合治疗。DPP-4抑制剂西格列汀具有较为独特的优势和特点。1，西格列汀降低HbA1c的幅度与格列吡嗪类似；2，其降糖作用为葡萄糖依耐性的，即是血糖高时西格列汀作用增强，而血糖低时却作用减弱，故而很

19、少引起低血糖的发生，这在糖尿病的治疗领域是一个突破和优势；3，使用西格列汀不增加体重，反而有减肥的作用，所以又是一个比较理想的降糖药物；4，不会引起乳酸酸中毒，可用于患有肾功能不全对患者，5，服药非常方便，每日西格列汀（100毫克/天）一次即可。吡格列酮为噻唑烷二酮类降糖药，药效肯定，价格低廉，在临床上广泛运用，不失为罗格列酮的绝佳替代品，最近的研究表明低剂量的吡格列酮长期治疗，可以显著改善糖尿病肾病患者的肾小球硬化和肾小管间质纤维化，延缓肾功能的恶化6，达到治疗的目的。而这些作用均与吡格列酮的抗氧化、抗炎、调节细胞生长因子、减少尿蛋白排泄率作用密切相关。吡格列酮已经被证实可以降低甘油三酯、增

20、加高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）而调节脂质代谢，从机制上有可能延缓或缓解动脉粥样硬化的形成7。大量研究表明吡格列酮可以减少TGF-1在肾小球和肾小管的表达8。同时吡格列酮可以减少TIMP-l在糖尿病大鼠心肌组织的表达，而其机制是通过抑制心肌纤维化的形成而实现的9，就机制来说均是对组织纤维化的抑制，西格列汀与吡格列酮均有对糖尿病大鼠肾皮质的TGF-1和TIMP-l的表达有抑制作用，那么合用效果是不是更佳呢？本实验进一步肯定了这一论点10。二者联用降糖效果更佳，各种并发症的发生延缓甚至能够阻止并发症的发生，特别对于糖尿病肾病的发生有较好作用，有待于进入临床试验进一步得到论证。ABCDE图1 各组

21、大鼠肾脏HE染色×200A：正常对照组、B：糖尿病模型组、C：西格列汀组、D：西格列汀+吡格列酮组、E：西格列汀+吡格列酮组参 考 文 献1 张坤,王瑞英,郝咏梅.胰高血糖素阳台-1在2型糖尿病中的作用J.新医学，2009,40(8):556-5582 Stephanie M.Yoder,Qing Yang,Tammy L.er al .Differential responses of the incretin hormones GIP and GLP-1 to increasing doses of dietary carbohydrate but not dietary pro

22、tein in lean ratsJ. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010,299(2): 476485. 3 李伟,张红,殷松楼,等.不同剂量链脲佐菌素诱导SD大鼠糖尿病肾病模型的研究J.徐州医学院学报,2006,26(1):52-55. 4 Nam JS,Cho MH,Lee GT,et al.The activation of NF-kappa B and AP-1 in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with Diabetic nephropathyJ.diabetes Research Clinical Practice, 2008,81(1):25-32.5 Toby C.Cornish,Serena M.Bagnasco,Anne M.Macgregor,et al. Glomerular Protein Levels of Matrix