青霉素发酵技术1.5 摇瓶种制作及培养(六步教学法)

1、教 案 首 页授课顺序 学时 日期 年 月 日 班级课题1.5 摇瓶种制作及培养学习目标学生通过查阅整理资料，结合教师讲解，学生能够理解实验室摇瓶培养原理；掌握摇瓶培养步骤；熟悉摇瓶种制作和培养工艺中的主要设备；掌握摇瓶种制作的主要工艺；熟悉摇瓶种制作中涉及的主要参数。主要内容（1）实验室摇瓶培养原理（2）摇瓶培养步骤（3）摇瓶种制作主要工艺（4）摇瓶种制作设计的主要设备（5）摇瓶种制作主要参数教学过程1、资讯 2、计划 3、决策 4、实施 5、检查 6、评价教具或工具 工作任务单、多媒体设备、灭菌锅、显微镜、超净工作台等载体产黄青霉培养物考核与评价采用工作任务单上的考核表进行评价，将评价结果

2、记入期末总成绩，并填写教师评语部分。轻工职业技术学院 教 案 NO 1 课程 青霉素发酵生产技术 201 /201 学年第 2 学期 教师 授课日期班 级工作过程：青霉素发酵生产技术教学任务1.3：产黄青霉菌株的平皿培养及菌种检测知识目标：（1）了解青霉素的分类及分子结构、作用机理应用等。（2）掌握青霉菌在固体培养基形态特征（3）熟悉青霉素产生菌生长发育过程（4）熟悉产黄青霉菌的特点（5）掌握大米孢子的制备方法。（6）掌握青霉菌菌种的保藏（7）掌握青霉菌的直接制片观察法（8）熟悉母瓶斜面固体培养基配方（9）掌握种子质量要求技能目标：（1）能配制察氏斜面培养基（2）会使用高压蒸汽灭菌锅（3）学会

3、无菌操作（4）会斜面划线接种产黄青霉菌株（5）学会使用恒温培养箱（6）会制备大米培养基（8）会配制乳酸石炭酸棉蓝染色液（9）会配制50%乙醇（10）会青霉菌直接制片（11）能正确使用显微镜（12）会制备菌悬液（供冻干用）（13）学会操作小型冻干机（14）会使用高频火花真空测定器测定冻干菌种真空度重点难点：（1） 青霉菌插片制片观察（2）青霉菌形态的准确鉴定（3）产黄青霉菌株保存 教学方法： “课堂，实训一体化”的现场教学方法；项目导入教学法。考核方法：组内自我评分和组间互评、实施过程评分、实验结果评分。学时安排：设计方案2学时、组织实施2学时教学札记： 编写日期：轻工职业技术学院 教 案 附

4、页教学组织一、分组学生全部进入发酵室后，将其分为7组，各组组长兼任安全员、副组长兼任设备材料员，达到学生的自管自治和相互监督，学生与教师的高度配合。二、工作过程导入（资讯）教师通过ppt向学生展示青霉菌液体摇瓶培养物，提出问题：大家想，由试管到茄子瓶培养物、再到液体摇瓶培养有什么变化？学生回答引导学生：容器大小？菌丝形态？产黄青霉生长数量？投入生产后生长扩增速度及进入合成代谢所需时间？最后得出结论。在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。菌丝体比孢子要有利：1、缩短发酵时间（产黄青霉深层发酵一般仅需2-7d就可获得大量的菌丝体，而固体培养则需30-60d。）2、有利于获得好的发酵结果

5、霉菌：生长较慢，如青霉菌，一般采用三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌丝，50-100L ）二级种子罐（ 27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体，500-1000L）发酵罐 继续引导学生思考：我们在实验室自己如何能获得青霉菌液体摇瓶培养物？附1：摇瓶种制作的原理产黄青霉摇瓶种制作是在发酵罐中，采用液体培养基通入无菌空气并加以搅拌，增加培养基中溶氧含量，提供产黄青霉菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，获得大量的菌丝体或代谢产物。 为何用三角瓶？通气问题怎么解决？装液量多少？液体培养基如何制作，接种量多少（还用孢子悬液吗）？通过孢子计数来获得一粒大米

6、的孢子数量，然后称量大米的克数及相应米粒数量，来推知其整体所含孢子数，来确定单位体积培养液的接种量(1粒米含1.4×106个孢子，接种量为200亿孢子/吨) 。得到的培养物能否检测其生长量？（答案是肯定的）一般用菌体浓度来反映培养液里菌丝生长量，通过溶液比浊度或单位体积菌丝体干重的测定来反映菌体浓度。三、教学任务导入（资讯）要求学生快速浏览青霉素发酵学习指导书上的参考资料，并提炼出液体摇瓶种培养制备的关键技术点，从而让学生建立对该工作过程的感性认识。接着教师随机指定学生回答问题：液体摇瓶种培养制备在青霉素发酵生产流程中的作用是什么？从而引出本次课要完成的任务。附2：摇瓶种子制备主要操

7、作步骤：称量煮制分装灭菌无菌检验接种振荡培养管理附3：液体种（三角瓶）制作的主要参数：1)培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。2)培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50 ml/ 250 ml瓶，60-80 ml/ 500 ml瓶，90-110 ml/ 750 ml瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上；3) 灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上4）注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧。 5）注意摇床中心

8、与边缘、上层与下层的温差引导学生分析液体摇瓶种培养制备的详细步骤，找出关键技术点，导出工作过程：由大米培养基（三角瓶或茄子瓶）培养物到液体摇瓶种的菌种扩增制备流程。四、任务实施1. 初步方案讨论（计划）以小组为单位，按照发酵实训任务书上的“任务1.5、产黄青霉制备及培养”的学习目标及任务要求，查阅学习指导书上的相应参考资料，通过学习，各小组分别讨论产黄青霉菌株的液体培养基制备、灭菌、接种、振荡培养及菌体浓度测定、填写项目任务书。2. 最佳方案筛选（决策）教师对各小组方案进行点评，推荐最佳方案，进行修改完善，并对其它小组的方案进行指导，找出错误或不足之处。同时，学生填写项目任务书。3. 方案具体

9、实施各小组按照产黄青霉菌株大米孢子制备制备流程的定稿方案，利用实验室的器材，具体实施：称量煮制分装灭菌无菌检验接种振荡培养管理，最后进行菌体浓度测定，制作自己青霉素发酵实训动漫演示作业。仔细观察实训生产的过程，对每一步都进行记录，最后完成小组用书的项目记录表。注意：亲米接种后或亲米接入生产米后要经过激烈振荡混匀才可放置恒温培养； 生产米要求每粒米的孢子量达到300万个以上。亲米、生产米孢子保存在 5 冰箱内。4. 关键能力的重点指导（检查）教师对学生的实践练习进行有效监控，巡回指导，及时指出不规范的操作。并对其关键能力进行重点指导。如培养基制备、灭菌、接种、振荡培养及菌体浓度测定等。5. 任务结果评价完成产黄青霉菌株的大米孢子制备任务后，各小组分别展示产黄青霉菌株的大米孢子三角瓶培养物。首先，进行组内自我评价和组间互评，接着，教师对每组结果进行评价，指出存在的问题和改进的方法。（附：评价项目包括：产黄青霉菌株培养物无杂菌污染、产黄青霉菌株在液体培养的生长指标、镜下能观察到典型的产黄青霉菌丝体。实际生产中每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及检查杂菌情况。）6. 任务小结 各组讨论进行