显微摄影一般知识

1、显微镜的主要光学参数说明1、分辨率显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称"鉴别率"。其计算公式是=/NA 式中为最小分辨距离；为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。2、放大率和有效放大率经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积,显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。3、数值孔径(NA) 数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而 言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。它是物镜前透镜与被检物

2、体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。4、焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层.焦深 目镜的视场 5、视场直径所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检

3、物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。视场直径=目镜视场数/物镜倍率6、覆盖差由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差.国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。7、工作距离(WD)工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。滤色镜对各种色光有选择吸收的特性，凡与滤色镜颜色相同的色光则能透过，而与滤色镜颜色互补的色光则被吸收。例如，绿滤色镜，在白光下把光谱中的蓝色光区段和红色光区

4、段全部吸收，只让绿色光段的色光透过，滤色镜显示绿色。黄滤色镜吸收蓝色光，透过红光和绿色光。红滤色镜，把光谱中由绿到红段的光波全部吸收，只让红色的一段光透射。蓝滤色镜吸收了由红到绿段的色光，仅让红色的一段光透射，蓝色滤色镜吸收了由红到绿段的色光，仅使蓝色光通过 在显微镜的光路上，加用滤色镜，从白光中减去与滤色镜颜色互补的色光，使改变的色光透射物体，造成影象色调和反差的改变。显微摄影利用滤色镜提高影象的反差和清晰度，以获得理想的底片，被摄物体反射出来的色光，如果被滤色镜透过，在黑白底片上产生相应的密度，印放出照片，这部分影调，比较明亮，假若该色光被滤色镜吸收，底片上的密度就薄，制出的照片影调就暗。

5、染色体用铁矾苏木精染色，呈蓝色，这种蓝色染色体，吸收红光和绿光，透过蓝光。摄影时加用蓝色的补色黄色滤色镜，可把照明光线中的蓝色光吸收，通过的是黄色光，滤色镜透射的色光，恰好是染色体吸收的色光，致使透射在染色体上的黄色光全被吸收，不再作用在底片上。尚须提及的一点：摄影时选用被摄体同色的滤色镜，可提高影象的分辨率。 滤色镜只限于用全色胶片拍摄时使用，不能到处滥用。对于只有黑白或灰色的物体影象，由于均匀的吸收或透射各种色光，滤色镜在此不起作用。如何调试显微镜聚光镜?道聚光镜是光学显微镜照明光路中的一个重要部件，但聚光镜的调试往往容易被用户忽略，以至视野中常因杂散光的影响而产生眩光或灰蒙蒙的效果。光学

6、系统中用于限制轴上点成像光束大小的光阑称为孔径光阑，如照相机中的可调光圈就是该系统的孔径光阑。孔径光阑限制轴上物点成像光束口径，限制到达像面的光能。孔径光阑的大小决定成像面上的照度孔径光阑与聚光镜是构成聚光器的两个重要部分。显微镜的性能主要决定于物镜的性能，而物镜的性能又决定于数值孔径。物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关，两者孔径相等时，物镜分辨力最高。聚光镜的数值孔径受孔径光阑控制，用孔径光阑的开放与收缩，调节聚光镜数值孔径的大小。显微摄影不同于一般摄影，其最大的区别是影象反差小，焦深浅。这两点可随孔径光阑缩小而提高。孔径光阑小于物镜的数值孔径时，物象的分辨力和亮度降低，但影象反差和焦点深

7、度提高，便影象更加清晰。所以，在不过多地降低分辨力的前提下，把孔径光阑调到所用物镜数值孔径的6080大小是比较合适的。例如，物镜的数值孔径为1.0，孔径光阑的数值调到0.60.8，所以，显微摄影时，缩小孔径光阑，尽管丧失少许的分辨力，却提高了影象反差、焦点深度和影象的清晰度。光学系统中用于限制成像范围大小的光阑称为视场光阑，如照相机中的底片框就是系统的视场光阑。视场光阑限制物面上成像的范围，即限制视场大小。光学系统中描述成像范围大小的参量称为视场。视野光阑位于镜座之中，用以控制照明光束的直径，缩小视野光阑，光束直径小于孔径光阑，视野亮度不足，影象不清晰；视野光阑开大，光束直径超出孔径光阑，因光

8、线过多，造成光线的乱反射，影响影象的清晰度。视野光阑的适宜大小，以光阑的边缘外切孔径或孔径光阑内接视野光阑为度(图3-13)。视场光阑随孔径光阑而变，总是外切孔径光阑以下是聚光镜调试的详细图文说明：1.聚光镜的中心调整。（1）调出清晰的多边形：将视场光阑和孔径光阑调到最小的状态，如果显微镜的状态正确，此时在视野中应该可以看到一个边缘清楚的多边形。如果看到的不是一个边缘清楚的多边形，则说明光路中的聚光镜上下位置不准确。此时转动聚光镜的上下调节旋钮（5.2），使聚光镜缓慢上升或下降，使得视场中形成一个边缘清晰的多边形。注意：不要经常调节聚光镜高度。调节好高度后，以后都不要再移动其高低位置。显微镜安

9、装好后，大多都已经调节好高度，所以可以直接进行下一步的调节。（有时如果找不到多边形，可以将视场光阑稍微放大，在稍亮情况下就可以找到。）（2）多边形调到正中心：视野中的多边形的正确位置应该是在视野的正中心，如果不在说明光路有偏移，需要调节聚光器对中螺钉（5.5），即两个银色的旋钮，使多边形在视野的中心。调节过程中看到的视野如下图。（3）多边形调成外切：将视场光阑慢慢放大，当多边形正好外切于视场的时候就是视场光阑的最佳工作位置。这样聚光镜的光轴调到了与照明光路以及成像光路的光轴合轴。调节好后，日常使用中不要乱调对中螺丝杆！2孔径光阑的调节：研究用显微镜的聚光镜的外侧边缘上均具有刻数及定位记号，便于

10、调节聚光镜与物镜的数值孔径相匹配。但有的聚光镜外侧没有标刻数字，这样先将物镜聚焦，再取下一个目镜，眼睛往镜筒内看，可见物镜后透镜呈一明亮的圆，如看不见孔径光阑的轮廓象，说明开得过大；若仅是一个很小的明亮轮廓象，则说明缩得过小，当缓慢增大刚好与物镜后透镜呈一明亮圆时，则聚光镜与该物镜的数值孔径已相互匹配。3.孔径光阑的主要功能：（1）、调节聚光镜的数值孔径，使其与物镜的数值孔径做出适当的配合，以取得最佳的分辨率。数值孔径与分辨率有密切关系，所以聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径要相匹配。例如：低数值孔径的物镜要配合低数值孔径的聚光镜，反之高数值孔径的油镜要配合高数值孔径的聚光镜。这样才能提高图象的分辨率。（2）、孔径光阑影响图像的反差。3.取景在显微摄影中要根