课程论文翻译

1、使用超声共振技术测定蛋白质的非离子表面活性剂CMC的配方（药剂学课程论文翻译）2015年 5月2日使用超声共振技术测定蛋白质的非离子表面活性剂CMC的配方Shohei Horiuchi ,Gerhard Winter摘要：生物制品通常含有表面活性剂配方中的稳定剂,以避免表面吸附的蛋白质药物，和界面的变性、聚集从而提高产品的整体质量。另一方面，在蛋白制剂中当表面活性剂浓度超过临界胶束浓度（CMC）时，蛋白胶束的形成可能是免疫原性的原因。 因此,实际的CMC和胶团的存在通常需要确认每个蛋白质配方,因为CMC影响了蛋白质和其他配方因素。 在这项研究中，超声波共振技术（URT）用于测定与比较

2、CMC中药物蛋白质溶液的表面活性张力（TE）和动态光散射（DLS）。结果表明，超声波共振技术可以很容易地和精确地提供蛋白制剂中表面活性剂CMC，而无蛋白制剂却测不出来。这表明，信号测量出的超声波速度来自胶束组成的表面活性剂和蛋白质分子。 DLS没有为蛋白质/表面活性剂系统提供可靠的数据。 有趣的是，与精氨酸和聚山梨酯20蛋白配方不同的表现时，TE和URT的研究让我们看到，精氨酸蛋白结合的复合物与表面活性剂的相互作用。关键词：蛋白表达；表面活性剂；超声波共振技术；临界胶束浓度；动态光散射1. 介绍 在过去几十年中制药公司已经开发出许多生物药品以治疗糖尿病、贫血、风湿性关节炎、癌症等严重疾病1。生

3、物制剂通常有高效力和毒性较低的选择性。 因此,生物制剂在市场中所占的百分比正逐渐扩大。为了生物制药的供应，药厂在开发和生产过程中必须克服许多障碍2。因为蛋白质在人体中通常是不能长期稳定储存的，蛋白质制药的稳定剂要在一个合适的PH值下模拟药物配方中含有非离子表面活性剂的稳定性，并且一些重要的销售产品需通过发表论文研究告知3。众所周知,表面活性剂可以降低蛋白质的聚合,从而降低免疫原性的风险。 同时,辅料可以减少机械应力,提高长期稳定性和溶解蛋白低溶解度的分子。因此可以添加表面活性剂的一个重要方面是配方的开发和后期的生产工艺验证。另一方面，表面活性剂能形成超过其CMC的胶束，并在某些情况下蛋白胶束能

4、像异物一样引起免疫原性8,9，10。 我们可以假设在病毒样颗粒的典型尺寸范围的胶束，承载在其表面上的蛋白质或多或少是''ordered”方式，是一种类型的颗粒疫苗制剂的进展 11 。这使得配方专家处在两难的境地，一方面需要确保足够的表面活性剂来避免或至少减少表面变性和聚合,另一方面排除过多的胶团的存在。 因此,科学家必须精确的决定是否可用表面活性剂胶束配制特定的蛋白质制剂。几乎所有的表面活性剂的CMC都在文献中列出，但这些数据的溶剂是纯水，众所周知，CMC可通过不同溶剂改变蛋白质的浓度12。 因此不可能只从CMC数据表计算它，但至关重要的是确定表面活性剂的CMC(或更好的胶团的

5、存在):可以更好的开发每个蛋白质制剂配方。 有许多方法可用于CMC的测定,但表面张力测量学(TE)和动态光散射(DLS)是最受欢迎的13,14,15和16。这种方法和容易是因为大多数制药实验室都有这些设备。,然而,这些方法有一定的缺点。DLS是一个光学方法,通过粒子，存在干扰杂质，影响了蛋白质聚集体和浊度。并且它不能区分粒子的表面活性剂胶束和蛋白质/蛋白质总量大约相同的问题。另一方面,DLS法是唯一的标准方法,观察其大量的解决方案,DLS并不是表面上直接检测胶束。表面张力的测量是最常用的CMC测定蛋白质溶液的方法，但它只是剔除表面活性剂胶束与单体之间的饱和度数据。它不能提供胶束存在的直接信息，

6、也不与本体溶液的表面活性蛋白存在相互作用。更多的,我们看到的表面上的蛋白质作用，即其表面位移或者与表面活性剂竞争,不直接与胶束作用。 为了克服这些问题，我们提出了超声波共振技术（URT），在这项技术中存在额外的方法测定蛋白质浓度。此外,我们希望提供一些新的、关于大多数常用表面活性剂用于胃肠道药物蛋白的CMC数据(EPO(促红细胞生成素)hGH,抗体)。因为目前为止，文献中没有提供出这样的数据。 超声波共振技术是很多年前开发的精确测量超声波的速度的一种技术，通过运行驻波超声波发生器和一个反射器来实行17。该方法的物理基础和应用程序所引用的文献是可用的18,17和19。超声波速度具有压缩性,“ha

7、rdness”材料的测量元件可以超声穿透。水溶液的硬度不仅存在自由水的量的复杂关系，溶质和水也是一种溶质的结构，特别是在溶解蛋白的情况下。在此基础上进行了一些调查，使用超声波速度测量研究蛋白质压缩体积稳定性的解决方法19,20,21,22,23,2425。即使此种方法确定CMC的原理存在很久26,(27),2829，然而,没有任何出版物发表关于应用URT去测定表面活性剂CMC的蛋白质含量配方的文章。 这种技术的优点是,(1)这是一个体积法,可以直接检测表面活性剂胶束的存在(2)它可以适用于高浓度蛋白质溶液(3)这不是一个光学方法,因此不受溶液浊度的影响，等等。另一方面，URT有一些局限性因为杂

8、质的高灵敏度,如更大的粒子。同时，应该小心溶液温度和测量谐振器细胞的有机溶剂的腐蚀。此外,因为这种方法是以本体溶液为象征，所以我们不能区分与本体溶液同时发生的不同的现象。 在这项研究中,确定超声波速度与表面活性剂的浓度,对于一个典型的CMC，其他方法测定都不如URT。希望看到压缩系数的改变和水化胶团形成时,蛋白质与表面活性剂形成胶束。令人惊讶的是,我们不仅能够从数据中确定蛋白质CMC /表面活性剂系统,当超过CMC时也可除去连接和结合蛋白的存在。但另一方面我们依然不能确定在纯水中表面活性剂的cmc是否会影响表面活性剂的灵敏度。2. 材料和方法2.1 蛋白质 单克隆抗体A IgG1（Mab A）

9、，人体生长激素(hGH)和促红细胞生成素(EPO)是被罗氏(潘茨堡,德国)和山德士(Kundl、奥地利)发明的。牛血清白蛋白是购自西格玛奥德里奇化学GmbH(Taufkirchen,德国)。Omalizumab是从市场购买的Xolair®注射器产品。 常用蛋白质配制方案制定如下:45毫克/毫升单克隆抗体在20毫升的组氨酸缓冲液中pH值为5.5，8毫克/毫升hGH 在10毫升磷酸缓冲液中pH值为7.0，9毫克/毫升EPO在7.5毫升的磷酸盐缓冲剂中pH值为7.0，150毫克/毫升omalizumab 在20毫升缓冲液中与200毫升0.04 重量 / 体积 %的精氨酸和组氨酸混合液合成聚

10、山梨酯20。20毫克/毫升的100毫升的柠檬酸盐缓冲液溶解粉末白蛋白BSA原液使之pH为6.1。2.2 化学物质 聚聚山梨醇酯80（PS80），HLB为15.0，自Fluka化学有限责任公司（Buchs，德国）购买。聚山梨酯20（PS20），HLB为16.7，经过超级精炼的吐温20 LQ-（MH）由Croda公司（Columbus Circle Edison，NJ，美国）购买。其他化学品，包括泊洛沙姆188（PX188），HLB为29，自Sigma Aldrich公司化学有限责任公司（Taufkirchen的，德国）购买。2.3 样品制备 对于URT和DLS，蛋白质样品溶液稀释储备液用水或缓冲

11、剂制成，稀释过程中加入的表面活性剂是以获得蛋白质溶液与表面活性剂的目的浓度。对于TE，蛋白储备溶液首先稀释，被稀释的蛋白质溶液通过每次测量结束后加入的表面活性剂滴定。2.4 超声共振技术 超声波速度测量是仪器TF公司（海德堡，德国）生产的ResoScan仪器。该仪器具有两个圆筒型电池应用于样品和参考溶液。当本研究为无蛋白制剂时，样品和参考细胞充满水（或缓冲液）和表面活性剂/水（或缓冲液）溶液，而对于蛋白质制剂，样品和参考细胞则充满了蛋白质/表面活性剂/缓冲溶液。对这两种物质的超声波速度同时进行测量，分别记录为U1和U2，以及U（= U 2-U1，它是减去由参考细胞样品单元的值）用于我们的评估。

12、在CMC测量，该仪器理论上检测表面活性剂，在与上述的CMC以及用于蛋白质制剂的关联捕捉变动蛋白质结构和水合状态围绕该蛋白质的信号。在测量前，都将细胞充满溶液，以冲洗细胞进行测试。然后将漂洗溶液完全抽出与样品和参比溶液的180微升注入细胞进行测定，小心地避免溶液出气泡30。2.5 表面张力测量 Wilhelmy法是用来自Kruss GmbH(德国汉堡)的K100张力仪来测量表面张力的，它的棒状探针PL03被用于所有的分析。每次测量前,探测器被纯净水和气体燃烧器燃烧去除水和潜在的污染物。约2毫升样品溶液置于一个小的金属容器中，并使之保持在预先设定的温度10分钟以上。在开始测量之前，张力计通过测量表

13、面张力相比纯溶剂，即水监测表面活性剂对液体样品的顶部表面上的积累。当空气/液体和液体/固体的界面充满饱和表面活性剂，此时溶液中表面张力达到平台期并且胶束形成2.6 动态光散射(DLS) 颗粒大小和派生的计数率在胶束形成时受到Zetasizer Nano-ZS莫尔文仪器GmbH(Herrenberg,德国)的影响。将430L的样品溶液放入一个GmbH(韦特海姆,德国)生产的一次性塑料试管中，确认没有气泡， 然后测量所有的样品。在这项研究中有一个低粘度数值接近于水，折射指数用PS20 PS80 PX188分别表示为1.469,1.472和1.466。平均每个测量时间间隔是120秒,其他所有参数DL

14、S自动设置。2.7 CMC的计算TE中的CMC通过DLS和URT数据图表的直线拐点来确定。3 结果与讨论3.1 CMC评估无蛋白配方 首先，无蛋白质制剂进行了测试，以确定由TE，DLS和URT等方法所测定的标准表面活性剂的CMC，然后，将不同量的PS20，PS80和PX188加入到水中并过滤，用0.22m过滤器与周围0.1-10w/ v的设备做成储备溶液。之后，稀释这些已过滤的作为储备溶液的水，以获得样品的各浓度。PS80在水溶液中的结果如图1所示，所有的CMC数据如表1所示。TE和DLS所测得的CMC值是相同的，但是URT对蛋白制剂无效。 这里提到的数值是很重要的，因为它是即将发表的关于设备

15、如何正常工作的文献数据。当将溶剂从水改为10mM磷酸盐和20mM组氨酸缓冲液时，CMC没有受到很大影响。URT无法确定CMC的值显然是因为由于信号太弱的原因以及受到表面活性剂分子在接近低浓度CMC水和缓冲区中水结构变化的影响。小分子或缓冲盐的存在不能放大超声波信号使表面活性剂胶束化。事实上PX188其中的CMC值是聚山梨醇酯的大约10倍，非常轻微的U可以通过URT来检测，但是在图S1中却没有迹象显示出CMC值。另一方面，TE和DLS可检测CMC。对于TE，它的监测属性为液体样品，其中所述表面活性剂性质是由它的两亲性质所决定。因此,如果连CMC值都相当低，那么TE就很容易影响到表面张力。对于DL

16、S，毫无疑问该仪器是公知的一个强大的工具，即使对于低浓度的样品，也可判定无蛋白质制剂的CMC。（见由Malvern发出例如应用说明31）。图1表1 总结cmc由URT相比TE和DLS。蛋白质表面活性剂CMC(w / v %)从文学表面张力测量学DLS超声共振N / A(水)PS200.00740.0040.007N / DN / A(水)PS800.00160.0020.0015N / DN / A(水)PX1880.03340.040.04N / DN / A(磷酸盐缓冲剂)PS20N /0.0080.007N / DN / A(组氨酸缓冲区)PS20N /0.0040.005N / D麦布

17、(10毫克/毫升)PS20N /0.008N / D0.008麦布(10毫克/毫升,蔗糖)PS20N /0.002N / D0.002麦布(10毫克/毫升,用生理盐水)PS20N /0.006N / D0.006麦布(40毫克/毫升)PS20N /0.007N / D0.008麦布(10毫克/毫升)PS80N /0.01N / D0.009促红细胞生成素PS20N /0.1N / D0.1促红细胞生成素PS80N /0.7N / D0.7促红细胞生成素PX188N /0.6N / D0.4人体生长激素PS20N /0.4N / D0.3人体生长激素PS80N /1N / D0.9BSAPS20

18、N /0.007N / D0.008BSAPS80N /N / DN / D0.04BSAPX188N /N / DN / D0.05OmalizumabPS20N /0.0080.0080.008N / A:不适用,N / D:不检测。3.2 CMC评估蛋白质配方 非离子表面活性剂通常用于蛋白制剂，以防止蛋白质从空气 - 液体界面以及液 - 固界面聚集并变性。为了保证表面活性剂有足够的可用表面用于蛋白质取代，所以该制剂必须具有足够高的浓度。另一方面，我们要避免潜在的免疫原性，因此，CMC测定中的非离子表面活性剂的许多微胶粒是用于蛋白质制剂的。由图2可知，我们绘制的CMC测定的代表性实例为3个

19、不同的模型蛋白素（EPO，hGH单克隆抗体A）和3个共同的表面活性剂（PS20，PS80，PX188）。 CMC的完整数据如表1所示。观察所有收集到的数据，显而易见的是，DLS不允许所选择的蛋白质模型存在CMC，而TE和URT在所有情况下那样。如图2所示，通过TE和URT对PS20的实验，使CMC的值为0.008 w/v%。从而发现Mab A中相同的拐点。如图2所示,U每个样品在低浓度PS20时保持不变,然后突然变大甚至超出0.008 w / v %。这表明，PS20胶束的形成必须具有蛋白质存在下扩增的超声波信号，所以迄今为止认为胶束是可检测的。我们应该记得，没有PS20形成的蛋白质微胶粒，U

20、RT就检测不到。因此，我们可以假设，该单克隆抗体与表面活性剂的CMC一定存在相互作用。这不仅使得CMC可用URT法测定，也直接表明，这种胶束将结合蛋白药物无论是在表面还是在核心。在蛋白质制剂的进一步研究中，以上CMC的情况还需要进行更加详细认真的研究。DLS不能在蛋白质存在时测量的一个原因是，Mab A和PS20胶束的粒径分别为6纳米和7纳米，（数据未示出）。这些尺寸是如此之近，使DLS不能明确区分,也不能检测出PS20胶束的形成。同时, 10毫克/毫升的Mab溶液的计数率在约6500 KCPS，而误差却有约100 KCPS，所以形成胶束的计数率的变化无法通过DLS检测的计数率。 图2代表数据

21、CMC测定研究了麦布/ PS20(得了),人体生长激素/ PS80(D-F),促红细胞生成素/ PS80(我的)和促红细胞生成素/ PX188(J-L)配方。 左(A、D、G J),中心(B,E、H、K)和右(C、F、我,L)显示为TE的数据,分别DLS和轨道交通。 蛋白质测试解决方案如下,麦布:10毫克/毫升麦布在20毫米组氨酸缓冲区在pH值为5.5,hGH:6毫克/毫升hGH在pH值7.0,7.5毫米磷酸盐缓冲剂EPO:0.5毫克/毫升EPO在2毫米磷酸盐缓冲pH值7.0。 每个数据点都平均有超过重复分析。 通过数据表一我们可以了解到，TE和URT所确定的CMC值相当接近。 随着几十年来t

22、ensiometric方法的不断验证,我们可以得出这样的结论:URT方法提供了更加合理的和可信的数据。此外，用此方法寻找到测量细节时的拐点似乎更加容易，换句话说这是一个更为精确的确定各自的cmc值得方法(图S2)。 由文献可知蛋白质的转移使蛋白质含量增高会影响表面活性剂的CMC值11。 因此，我们制备的10毫克/毫升和40毫克/毫升的MabA在20mM组氨酸缓冲液中测试CMC值。其结果是，TE和URT所测的CMC值分别为0.007和0.008 w/v%（见表1）。所以当我们观察到蛋白质浓度越来越高时CMC不得不发生转变。然而，如果我们比较在水中表面活性剂的CMC与在蛋白质溶液中的CMC，我们可

23、以看到CMC向着更高的趋势发展。这种现象可能与两个聚山梨醇的研究，及here.hGH和EPO制剂与聚山梨醇在0.1-0.9w/v%时反应显示的CMC值（用TE以及与URT）有关，这是该单抗制剂与无蛋白质溶液的比较结果（图2）。假设这些蛋白质相互作用比单克隆抗体与表面活性剂的作用更强烈。事实上，尽管在溶液中的总绝对蛋白质浓度偏低，但相对于被从本体溶液中抽出的用于形成胶束的游离PS分子还是偏高。从文献中查到一些研究表明蛋白质和表面活性剂的相互作用，例如，作用于hGH和EPO的衍生物之间，作用于单克隆抗体4,32-35。此外，对于EPO我们使用PX188相同的研究和相同的趋势，用三种方法证实聚山梨醇

24、（图2和表1）。 BSA是一种独特的蛋白，因为其结构存在疏水口袋，并且有许多报告证实了血清白蛋白和表面活性剂12,35-38之间的相互作用。对于BSA的制剂与PS20我们通过TE和URT测量出几乎相同的CMC值（图3）。因为CMC值非常相似，所以确定PS20存在MAB A.一个值得注意的地方是，CMC的核心是非常明确的，易于使用URT，而TE则显示出一个弯曲的图，很难用表面张力/浓度曲线来表示。这样非典型，非线性曲线已在文献中被描述为张力测量13。对于PS80和PX188 来说URT是判定一个独特的CMC值唯一的方法，因为TE法失败，DLS法不能提供任何有用的信号（图S3）。图3滴定研究BSA

25、 / PS20配方使用TE,DLS和URT。 BSA浓度每个样本被调整为10毫克/毫升在100毫米柠檬酸缓冲pH值6.1与PS20样品制备过程中。 每个数据点都平均有超过重复分析。3.3 辅料对超声共振技术的性能的影响 通常,我们会在生物制剂的配方中加入缓冲液和其他辅料，如糖，盐和表面活性剂，以确认糖或盐是否干扰了URT的性能。CMC测定研究用单克隆抗体A和5蔗糖100mM氯化钠的混合液反应。从而用TE和URT分析,PS20的CMC中，Mab A与蔗糖和氯化钠的存在为0.0020.006 w / v的，分别用图4和表1表示（用两种方法表示完全相同的值）。总而言之，糖和盐的存在对URT不能形成干

26、扰作用。图4。调查的影响存在5%的蔗糖在10 mg / mL麦布解决方案制定与20毫米组氨酸在pH值5.5和PS20缓冲区。 平均数据显示为一式三份分析。3.4 CMC评估omalizumab Xolair配方 Omalizumab(Xolair®)作为在市场上可用的模型蛋白。 omalizumab的样本是由Xolair制剂用精制水稀释，获得10毫克/毫升omalizumab溶液。如图5，CMC值被0.008 w / v % 的TE和URT所决定。然而，超声波速度增量使CMC急剧下降，相比于其他蛋白质制剂的效力是完全不同的。此外，通过DLS所导出的计数率，也可用其他两个方法确定相同的CMC值。图5滴定研究使用10毫克/毫升omalizumab解决方案制定与1.3毫米组氨酸缓冲区,精氨酸和PS20 13毫米。 每个数据点平均一式三份分析。 omalizumab的配制用已知蛋白质精氨酸39的疏水区域相互作用。通过对于超声波速度上精氨酸的效果调查，使用单克隆抗体与精氨酸的溶液来检查这种现象，以及其他抗体进行额外的滴定研究。通过滴定精氨酸到10毫克/毫升的Mab溶液中，精氨酸浓度随着超声波速度的增加而增加（图6）。这表明，Mab A和精氨酸之间的相互作用可以用URT法进行检测。此外，将聚山梨酯20加入到10mg / mL的Mab溶液及100mM