实验硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶实用教案

1、一、实验一、实验(shyn)背景背景 了解硫酸铵沉淀蛋白质的原理；掌握了解硫酸铵沉淀蛋白质的原理；掌握(zhngw)分级沉淀分离酶的基本操作分级沉淀分离酶的基本操作和方法和方法第1页/共16页第一页，共16页。二、实验二、实验(shyn)原理原理 盐析：盐析： 在蛋白质溶液中加入一定量的中在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋性盐（如硫酸铵、硫酸钠等）使蛋白质沉淀析出称为盐析，因为中性白质沉淀析出称为盐析，因为中性盐在水中解离时，能夺走蛋白质胶盐在水中解离时，能夺走蛋白质胶粒表面的水分子，破坏水膜结构；粒表面的水分子，破坏水膜结构；同时中性盐解离后形成的带电离子同时中性盐解

2、离后形成的带电离子能中和蛋白质表面的电荷能中和蛋白质表面的电荷(dinh)，这两种作用使溶液中蛋白质沉淀析这两种作用使溶液中蛋白质沉淀析出。出。第2页/共16页第二页，共16页。 分级沉淀：分级沉淀： 不同盐浓度下各种蛋白质的溶解度是不不同盐浓度下各种蛋白质的溶解度是不同的，因此调节溶液的盐浓度可使各种同的，因此调节溶液的盐浓度可使各种蛋白质先后沉淀出来，或者使需要的酶蛋白质先后沉淀出来，或者使需要的酶与其它杂质蛋白分开，达到提纯目的，与其它杂质蛋白分开，达到提纯目的，这就是分级沉淀法。这就是分级沉淀法。 硫酸铵沉淀一般在蛋白纯化硫酸铵沉淀一般在蛋白纯化(chn hu)的步骤中前期用，它简便且

3、重复性好，的步骤中前期用，它简便且重复性好，但纯化但纯化(chn hu)倍数不高。分级沉淀倍数不高。分级沉淀中需加的固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液中需加的固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液的量，可从硫酸铵饱和度量表中查得。的量，可从硫酸铵饱和度量表中查得。第3页/共16页第三页，共16页。第4页/共16页第四页，共16页。苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine:ammonia lyase，简称PAL）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物的正常生长发育和抵御病菌侵害的过程中起重要作用。PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨

4、，产物反式肉桂酸在波长290nm处有最大吸收值。在反应系统中如果酶的加入量适当，反式肉桂酸的生成速率即A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此，可通过测定A290 升高的速率来测定PAL的活力。规定1小时内A290增加0.01为PAL的一个(y )活力单位。第5页/共16页第五页，共16页。三、实验三、实验(shyn)试剂试剂 0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（PH8.7） 酶提取液0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（内含1mmol/L EDTA、20mmol/L-巯基乙醇）。取100ml 0.1mol/L 硼酸-硼砂缓冲液（PH8.7）,加入0.037克EDTA钠盐，混匀，临用前再加入0.

5、137ml-巯基乙醇，混匀； 0.6mmol/L L-Phe溶液。 称取L-Phe 9.912毫克(ho k)溶于100ml蒸馏水中； 6N HCl溶液 固体（NH4）2SO4第6页/共16页第六页，共16页。四、实验四、实验(shyn)步骤步骤 1、 酶液提取：酶液提取： （1）取小麦幼苗（发芽）取小麦幼苗（发芽56天）天）2克，用剪刀剪成小段后，立即放入有克，用剪刀剪成小段后，立即放入有10 ml酶提取液的研钵酶提取液的研钵(yn b)中，于中，于冰浴上研磨匀浆，匀浆结束前，再加冰浴上研磨匀浆，匀浆结束前，再加入入10ml酶提取液研磨混匀酶提取液研磨混匀 （2）将已匀浆的酶液，用三层纱布）

6、将已匀浆的酶液，用三层纱布过滤、挤干。滤液转入离心管，平衡过滤、挤干。滤液转入离心管，平衡后，于后，于10,000 g下冷冻离心下冷冻离心30min； （3）取离心后的上清液（酶粗提）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积液），量出其体积V1，放置冰浴中备，放置冰浴中备用。用。第7页/共16页第七页，共16页。实验实验(shyn)步骤步骤 2. 硫酸铵分级沉淀酶蛋白：硫酸铵分级沉淀酶蛋白： （1）从酶粗提液中吸取出）从酶粗提液中吸取出0.5 ml，以作后面活力测定等用，根据实际以作后面活力测定等用，根据实际体积体积(tj)和硫酸铵饱和度用量表，和硫酸铵饱和度用量表，算出达到算出达到40%饱和

7、度实际应加入酶饱和度实际应加入酶液中的硫酸铵量，并称取该量的硫液中的硫酸铵量，并称取该量的硫酸铵；酸铵； 第8页/共16页第八页，共16页。第9页/共16页第九页，共16页。（2）将酶液到入烧杯内，烧杯置于冰浴中，然后在边缓慢搅拌下缓慢加入称好的固体硫酸铵（不能有大颗粒(kl)，放在研钵中研碎），待全部硫酸铵加入后，再缓慢搅拌20min；第10页/共16页第十页，共16页。实验实验(shyn)步骤步骤 2. 硫酸铵分级沉淀酶蛋白：硫酸铵分级沉淀酶蛋白： （3）将上述溶液到入离心管，）将上述溶液到入离心管，3,000g下冷冻离心下冷冻离心30min，倒上清液于烧杯内，倒上清液于烧杯内，保留沉淀，

8、记为沉淀保留沉淀，记为沉淀1； （4）根据硫酸铵饱和度用量表中，查）根据硫酸铵饱和度用量表中，查出从出从40%到到75%饱和度所需硫酸铵用量，饱和度所需硫酸铵用量，算出并称取实际算出并称取实际(shj)应加的硫酸铵量；应加的硫酸铵量； （5）按上述（）按上述（2）、（）、（3）步同法处理，）步同法处理，离心后，倒出上清液，保留沉淀，记为离心后，倒出上清液，保留沉淀，记为沉淀沉淀2。第11页/共16页第十一页，共16页。实验实验(shyn)步骤步骤 3.酶活力测定：酶活力测定： （1）将沉淀）将沉淀1和沉淀和沉淀2分别溶于分别溶于1ml酶抽提液中，待沉淀全部溶解后，酶抽提液中，待沉淀全部溶解后，

9、量出其体积量出其体积V2、V3，记为沉淀液，记为沉淀液1和和2； （2）分别从沉淀液）分别从沉淀液1和和2中吸出中吸出0.2ml加入加入(jir)另外二个试管内，另外二个试管内，然后用酶提取液分别将其稀释成然后用酶提取液分别将其稀释成1ml，记为稀释沉淀液记为稀释沉淀液1和和2； （3）取试管）取试管7支，按下列编号并加支，按下列编号并加入入(jir)各试剂：各试剂： 管试 号 剂 0112233PH8.7 0.1mol/L 硼酸缓冲液（ml）4.03.94.93.94.93.94.9酶粗提取液(ml)/0.10.1/稀释沉淀液1(ml)/0.10.1/稀释沉淀液2（ml）/0.10.10.6

10、mmol/L L-Phe(ml)1.01.0/1.0/1.0/第12页/共16页第十二页，共16页。实验实验(shyn)步骤步骤 3.酶活力测定：酶活力测定： （4）以上试管放入恒温水浴）以上试管放入恒温水浴(shu y)（40）中保温）中保温60 min后，立即加后，立即加入入0.2ml 6N HCl，混匀，终止反应；，混匀，终止反应； （5）于波长）于波长290 nm处，以处，以0号管溶号管溶液调零，分别记录测得的各管液调零，分别记录测得的各管A290值。值。 酶活单位定义：规定酶活单位定义：规定1小时内小时内A290增加增加0.01为为PAL的一个活力单位。的一个活力单位。第13页/共16页第十三页，共16页。 1、PAL总活力计算： 分别(fnbi)