大肠杆菌授课PPt

1、组长：组员： 一、 目的1、 了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。 2、练习并掌握大肠菌群的检验方法。二、原理1、大肠菌群大肠菌群系指一群在37、24小时能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的亚属细菌组成。典型大肠杆菌的IMViC与硫化氢实验结果为+-2、测定的意义该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每1g（或mL）检样内大肠菌群最

2、可能数MPN（themostprobablenumber-简称MPN）表示3大肠杆菌的生物学特性基本形态： 此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。培养特性：

3、大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44 条件下仍能生长，生长温度范围15-46 。三 、 材料1、食品样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。2、阳性对照菌大肠杆菌 3、 仪器设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。 4、 培养基和试剂月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤、 煌绿乳糖胆盐（BGLB ）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ) 、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧

4、化钠（NaOH ) 、 1mol/L 盐酸（HCI ) 。 每个组准备的东西：250ml锥形瓶（一个是含有225ml的生理盐水，另一个是结晶紫中性红胆盐琼脂）12支试管（3支9ml生理盐水，7支月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤）1支10ml无菌移液管6支1ml无菌移液管（没有备用试管，请谨慎使用）8个无菌培养皿（没有备用器皿，请谨慎使用） 四、 检验方法第一法 大肠菌群MPN计数法。第二法 大肠菌群平板计数法。试验流程第一法 大肠菌群MPN计数法 1、样品的稀释（1） 固体和半固体样品 称取25g 样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000r/min-1000

5、0r/min 均质1 min-2 min ，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。（2） 液体样品以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10 的样品匀液。 （3） 样品匀液的pH 值应在6.5-7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。（4） 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中

6、（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。（5）、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min 。 2、 初发酵试验每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）, 361 培养24h2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至4

7、8h2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。（请大家明天中午过来观察，并且记录）3、 复发酵试验用接种环从所有48h2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐( BGLB）肉汤管中，361 培养48h2h ，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。4、 大肠菌群最可能数（MPN ）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN 表（见附录B ) ，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN 值。注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。 试验流程1、 样品的稀释直接使用按第一法中的

8、稀释液进行。2、 平板计数（1） 选取2个3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。（2） 及时将15 mL-20mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36l 培养18h-24h 。2、 平板计数 （3） 平板菌落数的选择选取菌落数在15-150 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。2、 平板计数 （4）、 证实试验 从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，361 培养24h-48h ，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。2、 平板计数（5）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大