猪APOBEC3F基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定

1、猪ap0bec3f基因克隆及真核表达载体的构建与鉴定孙宇二罗佳；马玉媛 章金刚1(100850北京军爭医学科学院野战输血研究i；解放军第305医院检验科2；广西大学动物科学技术学院彳)摘要目的 克隆猪载脂蛋白b mrna编辑酶催化多肽样蛋a 3f(apolipoprotein b nirna editing enzyme, catalytic polypeptide 3f, apobec3f)基因，构建真核表达载体实现其在体外表达与鉴定。方法 分离21周龄，体重在2530 公斤的雌性健康五指山猪4头的外周血单个核细胞，trizol法提取细胞总rna, rt-pcr技术特界性扩增目的基因， b的

2、基因插入真核表达载体pdsredl-nl及改造的pcdna3-flage载体构建农达质粒并在pk-15细胞小进行表达。激光 共聚焦显微镜及western blot方法对目的基因的表达进行鉴定。结果 克隆的目的基因与公布的基因序列同源性达99%； 激光共聚焦显微镜显示目的基因在pk-15细胞中实现了表达，且表达产物定位于细胞质内；western blot鉴定结果表明， 表达的h的蛋白大小与预期相符。结论 成功构建了猪apobec3f真核表达载体，为进一步研究其与猪内源性反转录 病毒(porcine endogenous retrovirus, perv)和互作用奠定了基础。关键词1apobec3

3、f；克隆；真核表达载体；鉴定the cloning of porcine apobec3f gene and the construction and identiflcation of eukaryotic expression vectorssun yu12, ma yuyuan1, luo jia3, zhang jingang 'institute of transfusion medicine, academy of military medical sciences, beijing 100085: 2the 305 hospital of pla laboratory d

4、epartment, beijing 100017； 'college of animals sciences & technology, guangxi university, nanning 530005)abstract objective to clone the gene of porcine apolipoprotein b mrna editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3f (apobec3f) and constmct the eukaryotic expression vector for the expres

5、sion and identification in vitro methods separating the peripheral blood mononuclear cells (pbmcs) from the bloods of four female healthy wuzhishan porcine which ages were 21 weeks and weight were 2530kg , then extracting the rna from the porcine pbmc by the trazo regent. the coding region of apobec

6、3f gene was ampl讦ied by rt-pcr, and then the gene fragment was inserted into the recombinant eukaryotic expression vector pdsredl-nl and pcdna3-flage-pa3f which had been transformed to construct the eukaryotic expression plasmids of pdsred 1 -n1 -pa3f and pcdna3-flage-pa3f, which were trans into pk-

7、15 cell by lip2000 transfection agent, respectively. the expressed products in the pk-15 cells were detected by fluorescence detection by the laser scanning confocal microscope and western blot. results the homologous of the gene which had been cloned was 99% compare to that published online the las

8、er scanning confocal microscope detected the red fluorescence of the expressed fusion protein of the pa3f and red fluorescent protein (rfp) and that located in the cytoplasm in the pk-15 cells the western blot detection also conformed the result of expression. conclusion the eukaryotic expression ve

9、ctor of porcine apobec3f, i.e., pdsred 1 -n1 -pa3f and pcdna3-flage-pa3f were successfully constructed, which lays experimental basis for study of apobec3f against perv.key words apobec3f； clone； eukaryotic expression vector； identification national natural science foundation of china: (3107185)corr

10、esponding author： zhang jin-gang, e-mail： zhangjg; ma yu-yuan, e-mail： mayuyuan()7 基金项目国家自然科学基金(3107185)i通讯作者章金刚，email： zhangig；马玉媛，email： mayuyuan07 天然免疫是机体抵御病毒感染的重要机制。近年來，一些介导天然免疫的新型宿主细胞因子陆续被发现，如载脂 蛋白 b mrna 编辑iw催化多肽样蛋白(apolipoprotein b mrna editing enzyme, catalytic polypeptide , apobec)家族、 trim家

11、族等。这类分了的发现为研究新型抗病毒约物提供了潜在的新靶标。apobec家族成员包括apobec 1. 2及apobec3ah,该类分子均具有胞唸噪脱氨酶活性，具屮抗病毒活性研 究比较集中和透彻的是a3g (apobec3g)和a3f (apobec3f)冋。研究发现这类分子不仅具有抑制hiv等反转 录病壽复制的功能卩，还可以抑制hbv等其它非反转录病壽的复制$忆 研究也发现动物体内也存在着该类分子发挥 着相同的抗病毒作用猪被认为是良好的异种移植供体，但猪体内存在的内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus, perv )因其口j以感染人源细胞叫川而受到关注。

12、猪体内存在的一种apobec分了apobec3f,具有抗反转录病毒的作用，但其是否具有抑制perv的作用h前尚无明确定论。我们通过rt-pcr方 法从猪外周血单个核细胞中(periphend blood mononuclenr cells, pbmc)克隆了猪a3f基因，并将其插入到真核表达 载体，在pk-15细胞中实现了对其表达和鉴定，为后续研究其与perv的相互作用捉供了实验基础。1材料和方法1.1实验动物与主要试剂4头21周龄，体重在2530kg的雌性、健康五指山小型猪，前腔静脉无菌采血loml采血后2 h内人淋巴细胞分 离液（购口上海肯强贸易有限公司）分离单个核细胞备用。trizolr

13、na提取试剂购口 invitrogen公司；superscript® iii反转录酶购口美国invitrogen公司；phusion高保真pcr扩增试剂盒购口美国neb公司，批号：0011102； ecor l not'、ki内切酶购自fi木takara公司；pcdna3-flag购自美国invitrogen公司经本宗改造；pegpf-n3载体购自美 国clontech公司;top10感受态细胞由实验室自制;t4快速连接酶购自北京tansgene公司,批号：e21214;直径10cm 培养h1l购白美国coming公司；hrp标记的抗flag标签抗体购白美国sigma公司，蛋

14、白marker购白北京天根生物技术 公司。建议将试剂及厂家在此处一一介绍。后而介绍方法时就可以省略对试剂厂家的介绍了。1.2rna提取与基因克隆trizo法（购b invitrogen公司）提取猪单个核细胞总rna。依据公布的猪apobec3f基因（fj042939.1 ）primer5.0 软件设计扩增引物并同吋在引物两端加上载体构建晦切位点，引物由北京屮美泰合生物技术公司合成。pcdna3-flag 载 体构建 引物： 上游 5 -ggaattcttatggatcctcagcgcctgagg-3 , 下游 5z- gcgcggccgcttatctcgagtcacttcttgg 3 ； pd

15、sredl-nl 载体构建引物：上游 5' ggggtaccatggatcctcagcgcctgagg-3",卜游 5x-ggggtacctctcgagtcacttcttgg-3zo 反转录反应条 件与体系：50 mmol/l下游引物3pb5pl模板rna,94°c预变性5 min,冰上加入supcrscriptlil反转录酶0.5ph 10 mniol/l dntp5pl, 5xbuffer 10pl, ddh2o 26.5 pl, 50°clh, 75°c10min （以上实验材料购自美国 invitroge n 公司）。pcr 扩增 反应条

16、件与体系：50 mmol/l ±下游引物各 1 pl, cdna 模板 2 pl, 10 mmol/l dntp lpl, 5xhe buffer 10pl, phusion 高保真酶 0.25 pl （以上实验材料购口美国 neb 公司），ddh2o 34.75 pl, 98°c 1 min, 98°c 20s, 64°c 30s, 72°c 2 min, 30循环，72°c5min。pcr产物2%琼脂糖凝胶电泳分析并回收纯化，分别依据酶切位点对产物进行过夜双酶切，同吋 对相应载体进行相同酶切处理，冋收酶切产物备用。1.3表达载体构

17、建丁4快速连接酶（购自北京全市金公司）连接2中pcr产物酶切物与载体pcdna3-flag> pdsredl-nl酶切产物， 操作按试剂说明。连接产物转化top10感受态细胞，挑取阳性菌落并进行菌落pcr及双酶切鉴定。构建的载体送北京 奥科公司测序分析。1.4基因表达与鉴定pk-15细胞（本室保存）培养至约90%融合率，roche公司x-tremgene hpdna转染试剂按说明书操作转染构建 的pcdna3-flag-pa3f与pdsredl-nl-pa3f各1块10cm培养皿同时设置转染空载体对照皿各1块。转染48 h后进行 荧光纤维镜与激光共聚焦显微镜（rfl军事医学科学院仪器屮心

18、完成），以及western blot鉴定目的基因表达。2结果2.1 fi的基因克隆与鉴定经rt-pcr扩增后pcr产物经2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示扩增到符合预期大小（1254bp）的基因片断， 见图1。扩增产物插入pcdna3-flag载体、pdsredl-nl载体经菌落pcr与双酶切鉴定（图2）正确后测序分析，测序 结果表明与网上登录的猪apobec3f基因（fj042939.1）同源性达到99%,氨基酸序列同源性达99%。构建的载体序 列正确，符合表达要求。1231254bp1： pa3f pcr扩增产物；2：空白对照：3： dl2000标准图1 pcr扩增pa3f琼脂糖凝胶电泳图l

19、:100bp; 2: 250bp; 3:500bp; 4: 750bp; 5: looobp; 6: 2000bp1254bp1： pa3f pcr 产物对照;2： transp i us2000marker； 3：pdsred1-n1-pa3f 双酶切产物：4： pdsred1-n1 空载体双酶切产物:5： pcdna3-f lag-pa3f双酶切产物：6： pcdna3-flag空载体双酶切产物图 2 构建的 pcdna3-flag-pa3f 载体、pdsred1-n1-pa3f载体双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图1 :l()()bp; 2: 250bp; 3:5()()bp; 4: 75()b

20、p; 5:looobp; 6: 2000bp; 7: 3000bp; 8: 5()()()bp2.2猪apobec3f基因在pk-15细胞中的表达与鉴定构建的pcdna3-flag-pa3f与pdsredl-nl-pa3f载体分别在pk-15细胞小进行表达。激光共聚焦显微镜观察显示 1=1的基因在pk-15细胞屮实现了表达。与空荧光表达载体对照表达结果相比，插入有-目的基因的载体蛋白表达分布不 同：空载体对照显示荧光蛋白弥散分布于整个表达细胞，而载冇冃的羞因的载体蛋白表达分布于细胞质内，核内没冇 表达产物分布，结果见图3。构建的pcdna3-flag-pa3f转染pk-15细胞36h收取细胞，

21、hrp标记小鼠抗flag标签抗 体western blot鉴定，鉴定结呆见图4。western blot结果显示pa3f (porcine apobec3f)蛋口在pk-15细胞中实现了 表达，蛋白大小位于4555x10'z间，约50x 103左右，与蛋口实际大小49.6x 103相符。实验结果表明构建的 pdsredl-nl-pa3f与pcdna3-flag-pa3f载体序列正确，且能够在pk-15细胞屮实现表达，产物人小与预期相符。20 pmabca：空pdsred1-n1载体转染pk-15细胞后蛋白表达20x； b： pdsred1-n1-pa3f载体转染pk-15细胞后蛋白表达

22、20x： c： pdsred1-n1-pa3f载体转染pk-15细胞后蛋白表达100x图3 pa3f基因在pk-15细胞中表达激光共聚焦显微镜观察55kda1:转染空 pcdna3-flag 载体细胞：2：转染 pcdna3-flag-pa3f载体细胞图4 pa3f蛋白在pk-15细胞中表达western blot鉴定检测抗体为hrp标记的小鼠抗flag标签抗体3讨论近年发现的天然抗病毒分了 apobec3家族分了己成为众多研究者关注的焦点，大量研究表明其具冇抗反转录病 毒感染的作用，其中研究比较透彻的即为apobec3g、a3f。a3g、a3f分子具有两个保守的、依赖锌离子的胞唏噪 脱氨酶(

23、cytidine deaminase, cda)活性位点模体，即 his/cys-x-glu-x23-28-pro-cys-x2-cys1131,反转录病毒株在非允 许细胞中复制晚期时，细胞内apobec分子被人量包装入新装配的子代病壽粒子中。子代病毒粒子感染新的细胞，进 入下一复制周期时，apobec分子被释放出来，针对反转录产生的负链cdna,导致c-u的突变。突变产生的过多u 碱基会十扰i:链dna合成的起始，导致宿主细胞内病毒基因组dna量下降，同时还会造成止链dna中g-a的高 频突变，从血抑制病毒的复制与感染，3-151o另外该类分子还可通过阻抑反转录酚与病每模版rna结合，抑制反

24、转录 病毒复制w山于该类分子是宿主体内固有成分，它们的发现即可为研究新型抗反转录病毒药物提供新的作用靶标， 具有重要的意义。猪体内含有内源性反转录病毒(perv),相关研究表明该病毒可以感染人源细胞而猪是冃前被寄予厚望 的界种移植的良好供体，由于其体内存在perv病毒，而使其生物安全性受到重视。如果能够证实猪体内存在的 apobec分子能够抑制perv,而人体内也存在相同或近似的机制，则其感染人进而造成人致病的儿率就会减少，也 使猪作为异种移植来源供体的使用范围变得更为广阔。另外，相关研究证实猪体内仅有一种ap0bec3f分子2,同时 其感染冇反转录病毒perv,这就为研究单一 apobec分

25、了与反转录病毒的相互作用提供了一个天然模型，更易于揭 示apobec分子抗病毒作用或反转录病毒逃逸该类分子作用机制，为进一步研究新型抗反转录病毒药物的研制提供分 子生物学基础。我们通过克隆猪体内的a3f基因，构建了真核表达载体，并在体外实现了对该基因的表达与衣达产物的初步鉴定。 实验结果表明构建的载体能够使猪的a3f基因良好表达，表达产物符合预期，为下一步进行pa3f分子与perv相互 作用机制研究及其单克隆抗体制备奠定了基础。参考文献fl lehner t, wang y, whittali t, et al. innate immunity and hiv-1 infectionfj. a

26、dv dent res. 2011, 23(1):19-22. smith jl, pathak vk. identification of specific determinants of human apobec3f, apobec3c, and apobec3de and african green monkey apobec3f that interact with hiv-1 vifj. j virol. 2010,84(24):12599-608.3 sheehy am, gaddis nc, choi jd, malim mh. isolation of a human gene

27、 that inhibits hiv-1 infection and issuppressed by the viral vif protein. nature. 2002,418(6898) :646-650.4 lecossier d , bouchonnet f, clavel f, et al. hypermutation of hiv-1 dna in t he absence of the vif protein. science , 2003 , 30() (5622) : 1112.5 bonv in m, achermann f, greeve i, ct al. intcr

28、fcron-in-duciblc exp rcssion of apo-bec3 editing enzymes in human hepatocytes and inhibition of hepatitisb viius replication j. hepatology ( baltimore, md) ,2006,43 (6) :1364-1374. nguyen d h, gummuluru s, hu j. deamination2independent inhibition of hepatitis b virus reverse transcrip tion by apobec

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