还原糖含量的测定(Somogyi～Nelson法)

1、还原糖含量的测定（Somogyi-Nels on 比色法）一.目的在植物营养及代谢研究中，常需测定还原糖的含量，本实验要求掌握Somogyi-Nelson比色法的测定原理。原理还原糖是具有羰基（ C = O ）的糖，能将其他物质还原而其本身被氧化。（1）还原糖在碱性条件下加热，在酒石酸钾钠存在的情况下，可以定量地将二价 铜离子还原为一价铜离子，即产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体 反应如下：CuSO4 十 2 NaOH-*Na2SO4十 Cu （OH） a 心H0-Cu(OH)2 +HOCH2COONa+ 2H2OCOOKCHCOONaoI-c/CHCOOK生成的Cu复合物与糖反应，

2、Cu生成氧化亚铜（Cu 2 O ）。（2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖含量 （即被还原的Cu 2 O量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后用做标 准，就可测得样品中还原糖含量。三、仪器、试剂和材料1 .仪器（1）分光光度计2 ）水浴锅3 ）具塞刻度试管：15ml X 104 ）吸管：1ml X 1，2m1X4，5ml X 35 ）容量瓶：100m1 X 26 ）漏斗7 ）研钵（8 ）电子顶载天平2 试剂（1）铜试剂A. 4 % CuS04 5H20B. 称取24g无水碳酸钠，用850m

3、1水溶于大烧杯中，力卩120g含4分子 结晶水的酒石酸钾钠，待全溶（可适当加热）后加入碳酸氢钠16g,再加入120g 无水硫酸钠，全溶及冷却后加水至900m1，沉淀12天，取上清液（要求严格 时过滤）即可备用。使用前将A与B按1 : 9混匀即可。（2 ）砷钼酸试剂：25g钼酸铵溶于450ml蒸馏水中(加热溶解，但温度接近 150 C时易分 解),待冷却后再加入 21 ml浓H2SO4混匀。另将3g砷酸氢二钠(Na2HAs04. 7H20)溶解于25ml蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中 可长期备用。(3) 200ug/ml葡萄糖标准液：准确称取分析纯葡萄糖200mg溶解定容到

4、1000ml。3 .材料新鲜植物组织。四、操作步骤1. 标准曲线的制作在7支刻度试管中，分别加入 200ug/ml标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6ml，再顺序加入蒸馏水 2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4ml， 配成每毫升含0、10、30、40、50、60ug葡萄糖的溶液。每试管加入铜试剂2m1, 混匀后沸水浴中加热10min，立即冷却，再加入2m1砷钼酸试剂，振荡两分钟 后稀释到15ml,用分光光度计在620 nm波长下比色，测其吸光度。以糖含量(ug )为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2. 植物样品还原糖的提取将样品洗净，吸干其表面

5、水分，切碎混匀，称取 1g放入研钵中，加入石英 砂约0.5g,磨成匀浆，将样品转移至100m1三角瓶中，加水约70- 80m1,摇 匀置于80 C恒温水浴上浸提半小时。待样品冷却后，沉淀蛋白质：加入 5%硫酸锌5ml,再慢慢滴入0.3 mol/L Ba(OH)2 5m1,以沉淀蛋白质。振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴 Ba(OH)2 ,直至无白色沉淀时，溶液转移至 100m1容量瓶并加水至刻度。3. 还原糖含量的测定过滤上述已定容的样品液，取 5ml滤液，再定容到100m1 (此步视样品的 含糖量而定)。取已稀释的溶液 2ml ，与标准葡萄糖溶液显色法相同：加铜试 剂2ml，煮沸l0min，加砷钼酸试剂2m1,振荡2min，定容到15ml， 620nm波