TLR4在糖尿病大鼠脊髓中的表达及其意义

1、单位代码：10660学号：10660s090466屮闲图书资料分类法分类号：r741，r392.9贵阳医学院 2012届硕士学位论文tlr4在糖尿病大鼠脊髓中的表达及其意义研究生：颜建娥 导师： 王迪芬教授朱涛 教授 年级：2009级专业：麻醉学2012年5月28日冃录摘要，”，”，”，”，3刖冃5材料与方法7结果，”15讨论21参考文献23英文摘要26致谢，29略缩词表30论文原创性声明31附:综述，今，赘，今，今，赘，32tlr4在糖尿病大鼠脊髓中的表达及其意义麻醉学研究生：颜建娥导师：王迪芬教授朱涛教授摘要目的研究toll样受体4 (tlr4)在糖尿病大鼠脊髓中的表达变化，探讨tlr4

2、与糖鉍病并发症神经病理性疼痛的关系。方法84只spf级sd雄性大鼠，体重180-200g，将大鼠随机分为两组：正常对 照组(c组，n=42)和糖尿病组(dm组，n=42)。大鼠禁食14h后dm组按65mg/kg 一次性腹腔注射ph=4.38、浓度为1%的链脲佐菌素(stz)溶液，c组腹腔注射 相同剂量的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。一周后断尾取血测血糖，空腹血糖>16.7 mmol/l的大鼠为糖尿病模型制备成功。分别在ow、lw、2w、3w、4w、6w、8w 时测定大鼠体重、血糖，用电子测痛仪测定机械痛阈，采用iit336型甩尾足底 测试仪测定热痛阈。每组测定完上述指标后随机取6只大鼠，用10

3、%的水合氯醛 按200mg/kg腹腔内注射麻醉sd大鼠，快速取l4-6节段脊髓放入液态氮中保存。通过pcr基因扩增仪用rt-pcr法测定人鼠l4-6脊髓tlr4的相对表达量，elisa 法检测脊髓tnf-a、il-lp的变化，用spss17.0统计结果。结果与制模前相比，dm组腹腔注射stz后lw、2w、3w、4w、6w、8w时 血糖浓度显著升高，c组血糖无明显变化；dm组腹腔注射stz后体重逐渐下降, c组体重逐渐增加。dm组机械痛阈在2w、3w、4w呈现逐渐下降趋势，4w时 降至最低并持续至8w，显著低于c组(p<0. 05); dm组热痛阈在4w明显降低 并持续至8w,低于c组(p

4、<0. 05),但8w时热痛阈较前又有回升，比6w时 显著升高(p<0. 05). dm组l4-6脊髓tlr4表达出现上调，并且lw、2w、3w、 4w呈现逐渐上升趋势，6w、8w 乂呈现逐渐下降趋势，lw、2w、3w、4w、6w时 tlr4表达均高于c组(p<0. 05),其中在4w时上升至最高；dm组l4-6脊髓 tnf-a 表达在 lw、2w、3w、4w、6w、8w 比 c 组显著升高(p<0. 05); dm 组l4-6 赞髓 il-1(3 在 lw、2w、3w、4w、6w、8w 比 c 组显著升高(p<0. 05)。将 dm组所有和对定量检测的l4-6脊

5、髓tlr4表达与其处死前所测得的机械痛阈 和热捕闹进行spearman线性相关性分析显示：dm组0w、lw、2w、3w、4w 脊髓tlr4表达与机械痛阈呈负相关(r=-0. 941)(p<0. 05),与热痛阈负相关 (r=-0.907)(p<0. 05)； 6w, 8w脊髓tlr4表达与机械痛阈和热痛阈无相关性。将 dm组所有相对定量检测的l4-6脊髓tlr4表达与tnf-ot和il-lp进行spearman 线性相关性分析显示：dm组ow、lw、2w、3w、4wtlr4表边与tnf-a呈正 相关(r=0. 98) (p<0. 05),与 il-lp 呈正相关(r-0. 8

6、7) (p<0. 05)；6w、8w 脊髓tlr4表达与tnf-a和il-ip无相关性。将dm组相对定量检测的l4-6脊髓 tnf-a和il-lp的表达与机械痛阈、热痛阈进行spearman线件相关性.分析显示：dm组ow、lw、2w、3w、4w、6w、8w脊髓tnf-a表达与机械痛阈成负相关 (r=-0.929) (p<0. 05),与热痛阈成负相关(r=-0.786) (p<0. 05) ; il-ip 表达与机 械痛阈成负相关(r=-0.750)(p<0. 05)，与热痛阈成负相关(r=-0.643) (p<0. 05)。结论糖尿病人駁早期脊髓tlr4表达增

7、高导致炎性细胞因子tnf-a和il-lp的释放，炎性细胞因子tnf-a和il-ip是引起糖尿病大鼠神经病理性疼痛的重要因素，因而tlr4表达增高与糖尿病大鼠早期神经病理性疼痛相关。【关键词】r/样受体4; tnf-a； il-1/3；糖鉍病；神经病理性疼痛；、/-身刖g随着社会人口老龄化和人类生活方式的改变，当今社会糖尿病的发病率急剧 上升。国际糖尿病联合会(international diabetes federation，idf)新公布的数据 显示现在全球约有2.85亿人得了糖尿病，糖尿病患者的人数仍在持续增长，如 果不采取行动阻止蔓延的趋势，到2030年糖尿病患者数量将接近4.4亿。根据

8、 中国糖尿病协会最新调杳发现，2010年中国的糖尿病发病率高达9.7%,仝国糖 尿病人接近一个亿，中国已成为全球范围糖尿病增长最快的地区，而且超越印度 成为“糖尿病第一大国”。糖尿病神经病理性疼痛是糖尿病最常见的慢性并发症 之一，其发病率已达60%以上。近年普遍认为糖尿病神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain, dnp)与高血糖引起的细胞内氧化应激和血管病变宵关，但临 床工作屮发现即使将血糖控制在正常范围，采用抗氧化剂、改善微循环药、营养 神经药、三环类抗抑郁药等治疗许多患者疼痛仍难以缓解，因此可能存在其他致 病机制。神经病理性疼痛是由外周或中枢神经系统损伤所引起的

9、疼痛，这些损伤 包括糖尿病神经病变，病毒感染和脊髓损伤等m。tlr是1型跨膜蛋白质，是天然免疫细胞膜上最重要的模式识别受体，可广泛的表达于哺乳动物免疫 相关细胞和部分非免疫细胞如上皮细胞和内皮细胞，识别内源性和外源性的 危险因子启动免疫应答m。tanga等人首次报道了 tlr4在神经痴理性疼痛中可能起作用，他在 腰5神经离断实验屮发现神经损伤后脊髓胶质细胞tlr4mrna表达上调， 随后他乂证实tlr4表达是神经损伤导致脊髓胶质细胞活化和热痛觉过敏所 必需的近期也有报道显示tlr4不仅在小胶质细胞激活和神经病理性疼 痛的产生上起作用，在神经病理性疼痛的维持上也起作用5.既然tlr4在神经病理性

10、疼痛的发生和维持过程中起重要作用，那么抑 制tlr4表达是否能减轻神经病理性疼痛呢？最近有多位学者对此进行了实 验。lan等人注入tlr4的小干扰rna抑制tlr4基因表达减轻了大鼠骨癌 后疼痛6.wu等人也在小鼠慢性缩窄性损伤模型屮发现注入tlr4的小干扰rna可以显著的减轻机械性感觉异常和热痛觉过敏？除了用抑制tlr4基因的表达， 釆用tlr4桔抗剂减轻tlr4效能对于减轻祌经病理性疼痛也有一定效果。在坐 骨神经损伤模型中，反复注入tlr4的拮抗剂fp-1可以抑制nf-kb的激活和tnf-a过度生成从而减轻机械性感觉异常和热痛觉过敏，在神经病理性疼痛的形 成过程中tlr4是关键受tlr4除

11、了对入侵的病原体起反应，他们在无病 原体存在吋也能起作用并能调节神经病理性疼痛的发生9。在既往研究中也发现糖尿病患者肌肉和单核细胞tlr4 mrna和蛋白表达 增加，并且在高糖环境中tlr4信号通路作用增强。有学者己发现tlr4信号通 路参与糖尿病大血管病变；tlr4还参与糖尿病肾小球硬化的发生和发展等11。但尚未研宄tlr4是否在糖尿病大鼠脊髓组织表达异常和证实tlr4通路与 糖尿病神经病理性疼痛是否具有相关性。在此前提下，提出本课题。目的是探讨糖尿病大鼠脊髓tlr4的表达是否异 常，与糖尿病神经病理性疼痛是否具有相关性，以期探索出糖尿病神经病理性疼 痛新的发病机制，为探索其治疗提供新思路。

12、材料与方法1材料 1.1试剂链脲佐菌素sigma，usatrizol试剂invitrogen，usa反转录fermentasfermentas, usatap酶大连宝生水合氯醛上海生工depc上海生工rt-pcr试剂盒大连宝生tlr4引物上海生工tnfa-elisa 试剂盒欣博盛生物illp- elisa 试剂盒欣博盛生物液态気thermo fisher双蒸水上海生工dna酶fermentas，usa氯仿上海生工异丙醇上海生工乙醇上海生工琼脂糖上海生工tbe缓冲液上海生工eb液上海生工仪器血糖仪roche,瑞士电子测痛仪北京硕林苑科技公司iit336型甩尾足底测试仪life science,

13、usapcr基因扩增仪bio-rad, usagds8000型uvp凝胶成像系统bio-rad, usa微波炉格兰仕稳压电泳仪及电泳槽bio-rad, usa紫外分光光度仪bio-rad,usaelx800酶标仪bio-tec, usa离心机bio-rad，usa电动恒温箱精宏电子微量分析天枰上海分析仪器厂超净工作台苏浄集团安泰公司锥形瓶上海医用器械吸管上海生工ep管上海生工研磨棒上海生工微量可调加样器上海金花1.3主要试剂配制1.3.1拧檬酸缓冲液1.3.1.1 a 液柠檬酸(fw:210.14)2.1g加入ddh2o至100ml充分搅拌至溶解，配成a液。1.3.1.2 b 液柠檬酸钠(fw

14、294.10)2.94g加入 ddlho 至100ml充分搅拌至溶解，配成b液。1.3.1.3柠檬酸缓冲液50 mlb 液50 mlph计测定ph值，调节ph=4.2-4.5,测得ph=4.38即是所需配置stz的柠檬 酸缓冲液。1.3.2链脲佐菌素溶液stz650mg柠檬酸缓冲液65ml充分搅拌至溶解，配成链脲佐菌素（stz）溶液。stz容易失活，stz快速 称取后仍要求干燥避光，建议用干燥铝箔（或锡箔）纸。1.3.3水合氯醛溶液水合氯醛10g100ml1.5g加入ddh2o至充分搅拌至溶解，配成水合氯醛溶液。 1.3.4 1.5%琼脂糖凝胶琼脂糖力口 0.5xtbe100ml微波炉加热至完

15、全溶解，待冷却至60°c以下，加入10mg/ml溴化乙锭5ul。2方法2.1动物选择及分组实骑遵从国际疼捕研究联合会相关指南，并得到贵阳医学院实验动物伦理委 员会的许可。清洁级雄性sd大鼠，84只，体重180-200g，由上海交通大学附 属上海市第一人民医院动物屮心提供。实验前动物在本实验室预检2d，动物饲 养室有良好的通风系统，室温维持在20°c,湿度55%左右，自由摄食水。随机 分为两组，糖尿病模型组（dm组，n=42）,正常对照组（c组，n=42）。两组根 据时间点不同又随机分七个亚组：制模前组（ow组，n=6）、制模1周组（lw组,n=6）、制模2周组（2w组，n=

16、6）、制模3周组（3w组，n=6）、制模4周组（4w 组，n=6）、制模6周组（6w组，n=6）、制模8周组（8w组，n=6）。2.2糖尿病大鼠模型的制备大鼠禁食禁饮14h后称量体重，将已配制的柠檬酸缓冲液与链脲佐菌素 （stz）配制成浓度为1%、ph=4.38的stz溶液，按65mg/kg 一次性腹腔注射。一周后断尾取血测血糖，空腹血糖16.7mmol/l （300mg/dl）的大鼠为糖尿病模 型制备成功。正常对照组腹腔注射相同剂量的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。2.3血糖、体重监测腹腔注射药物前、腹腔注射药物后lw、2w、3w、4w、6w、8w，分别称量 大鼠的体重并取尾静脉血测定空腹血糖浓度。

17、2.4行为学改变和痛阈测定2.4.1行为学改变观察制模前后大鼠饮水、饮食、尿量等的变化，观察大鼠步态、姿势及自由 活动程度。2.4.2痛阈测定制模前及制模后lw、2w、3w、4w、6w、8w进行机械痛阈和热痛阈测定。所有测定均在规定时间（9: 0012: 00）进行。测定痛w前要先使大鼠熟悉周围 环境，待其安静后在进行痛阈测定，以免不熟悉环境引起的躁动影响测量结果。2.4.2.1机械痛阈测定将大鼠放入底部为铁丝网的有机玻璃箱中，适应环境30min后测定机械痛阈 （paw withdrawal pressure threshold, pwpt）。用电子测痛仪刺激大鼠后肢足底中 部，刺激强度逐渐加

18、大直至出现缩足反应，记录电子测痛仪读数，连续测定3 次，每次间隔5min,取平均值为机械痛阈。2.4.22热痛阈测定：将大鼠罝于底厚为2mm玻璃板的有机玻璃箱中，使用热辐射照射其后足和 应的部位，记录从照射到出现缩腿反应的吋间，即缩腿潜伏期。测定3次，单次 光照吋间不超过30sec，每次间隔5min，取平均值为热痛阈（paw withdrawal latency, pwl） o2.5组织制备每组称量体重，测定血糖、痛阈后用10%的水合氯醛200mg/kg腹腔注射 (introperitioneal，i.p.)麻醉sd大藏后，剪去腰部脊柱毛发，用沾了生理盐水的 湿纱布擦去多余的碎毛发，剪断l4-

19、6节段脊柱，用镊子快速取出l4-6节段脊髓 放入己标记好的ep管中并放入液态氮中冷冻备用。2.6rt-pcr半定量测定脊髓tlr4 mrna表达变化2.6.1 tlr4引物设计引物由上海生物工程有限公司制作合成。tlr4(356bp): tlr4-f:5'-gcc gga aag tta ttg tgg tgg t-3'tlr4-r:5r-atg ggt ttt agg cgc aga gtt t-3'b-actin(240bp):b-actin-f: 5 '-cac gat gga ggg gcc gga ctc atc-3'b-actin-r: 5&

20、#39;-taa aga cct cta tgc caa cac agt-3' 2.6.2rt-pcr步骤、方法 2.6.2.1rna的提取，具体步骤如下:(1) 取50mg脊髓组织加入lmltrizol，在ep管内用研磨棒彻底研磨；(2) 浆，4°c, 3000 rpm,离心 5min,取上清丁新的 ep 管；(3) 加入氯仿200ul，剧烈震荡15sec,静置5min；(4) 4°c, 12000 rpm,离心 20min,取上清于另一个 1.5ml 的 ep 管；(5) 加入400ul异丙醇，混匀，室温放罝15 min；(6) 4°c, 12000

21、rpm,离心20min,丢弃上淸液，加入冰预冷的75%乙醇lml；(7) 4°c, 12000 rpm,离心 15min，洗两次;(8) 丢弃上清液，室温干燥5-10min,不能完全干燥；(9) 上述沉淀物中加入20uldepc水，即可进行转录。2.6.2.2rna纯度和含量的检测取2ulrna用depc水稀释至200ul，以depc水作对照，用波长260和280 测定od值。根据a260/280的比值衡量rna纯度，当a260/280的比值1.8时， 表示提取的rna被蛋白质等杂质污染；当a260/280的比值2.0时，表示提取 的rna部分降解；当a260/280的比值在1.8-

22、2.0之间吋，表示提取的rna既没有 降解也没有被污染，纯度较高。根据公式：rna浓度(ug/ml) =a260x40x稀释 倍数，计算出rna的浓度。2.6.2.3cdna 的制备逆转录体系的每个样木加入模板rna2ug、oligodtlul，加depc水至12 ul,42°c加热 60min 后冰上冷却，力卩 5xbuffer4ul、rnasin20u、dntp2ul 及 m-mulv 逆转泶酶200u，轻轻摇匀。2.6.2.4pcr 扩增tlr4扩增体系中各成分组成如下：loxpcr buffer2.5 ul25mm mgcl21.5ultaqdna 聚合酶1.0ultlr4-

23、f1.0ultlr4-r1.0uldntps2.0ulcdna模板（逆转录产物）2.0uldepc 水14.0 ul总体积25.0ulpcr反应体系共25ul,在pcr仪中30次反复循环扩增，扩增程序如下:温度时间95 °clomin94 °c30s162°c50s30cyclcs72 °c50s72 °clominb-actin作为tlr4mrna定量的内参同时被扩增，反应条件与tlr4mrna 的扩增条件一致。2.6.2.4加样及观察结果分别取各类扩增产物loul进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。用 biospectrumac凝胶成像分

24、析系统进行观察和照和。imagej1.37图像处理软件分 析产物条带的光密度值，以tlr4mrna/b-actin的比值来反应tlr4mrna的表 达水平。2.7elisa法测定脊髓tnf-(x、il-lp表达变化2.7.1组织匀浆提取取实验动物新鲜脊髓组织，以每克组织加3 ml裂解液冰浴超声匀浆，3 000 rpm,离心5 min,吸上清500 ul, -20°c冻存备用。2.7.2elisa 检测elisa检测，具体步骤如下：(1) 提前20min从冰箱中取出备用试剂，以平衡至室温；(2) 从己平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，空白空中加标准品和标 本通用稀释液，其余相应孔中

25、加己匀浆的标本或不同浓度的标准品(100|il/孔)；(3) 用封板胶纸封住反应孔，36°c孵箱孵育90min；(4) 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)；(5) 提前20min准备生物素抗体工作液，按当次试验所需用量，以生物素抗 体稀释液稀释浓缩生物素抗体(1: 30)成工作液；(6) 从孵箱取出板条，甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤 液350|il，静罝30s后甩尽液体，在吸水纸上拍干，洗板5次；(7) 空白孔加生物素抗体稀释液，其余孔加生物素抗体工作液(1001/孔)， 用新的封板胶纸封住反应孔，36"c孵箱孵育60min；(8) 提前20min准备酶

26、结合物工作液，按当次试验所需用量，以酶结合物稀 释液稀释浓缩酶结合物(h 30)成工作浓度，避光室温放罝；(9) 从孵箱取出板条，甩尽孔内液体，在洁浄的吸水纸上拍干，每孔加洗涤 液350pl,静置30s后甩尽液体，在吸水纸上拍干，洗板5次；(10) 空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加酶结合物工作液(1001/孔)，用新 的封板胶纸封住反应孔，36'c孵箱孵育30min；(11) 打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序；(12) 从孵箱取出板条，甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤 液350|il,静置30s后甩尽液体，在吸水纸上拍干，洗板5次；(13) 加入显色底物tmb (

27、100ul/孔)，避光36°c孵箱孵育15min；(14) 加入终止液(100ul/孔)，混匀后即刻(3min内)测量od450值。(15) 根据标准液结果得出标准曲线，求出各组浓度值。2. 8统计学处理计量资料所有数据采用spss 17. 0进行统计分析，计量数据以均数±标准差(x±s)表 示，组间的计量资料采用t检验，相关性分析采用spearman法。结果1.糖尿病神经病理性疼痛行为学变化dm组制模后明显出现多饮、多食、多尿、体重减轻等症状，休息时易群居， 有时突然舔咬后爪。c组注射缓冲液前后没有出现上述表现。2制模后大鼠血糖和体重变化如图一所示，dm组制模后

28、lw、2w、3w、4w、6w、8w血糖值比c组显著增 高（p<0. 05）;如图二所示，dm组lw时体重与c组相比无明显差异，随后dm 组体重逐渐降低而c组逐渐增加，差异显著（p<0. 05）。图一各组大鼠血糖的比较fig.i. comparison of glucose in ratsg lycacmia(mg/dl)time(wk)注：与c组比较，*p<0.05图二各组大鼠体重的比较fig.i. comparison of body weight in rats注：与c组比较，*p<0.05 3制模前后大鼠机械痛阈、热痛阈变化dm组机械痛阈在2w、3w、4w呈现逐渐

29、下降趋势，4w时降至最低并持续至 8w，显著低于c组（p<0. 05）（图三）。dm组热痛阈在4w明显降低并持续至8w，低于c组（p<0. 05），但8w热痛 阈较前乂有回升，th6w时显著升高（p<0. 05）（图四）。图三各组大鼠机械痛阈的比较（g，x=） fig.3. comparison of pwpt in rats注：与c组比较，*p<0.05图四各组大鼠热痛阈的比较（sec，x土s）fig.4. comparison of pwl in rats control注：与c组比较，*p<0.054糖鉍病大鼠l4-6脊髓tlr4表达 dm组l4-6脊髓tl

30、r4表达出现上调，并且lw、 2w、3w、4w呈现逐渐上升趋势，6w、8w又呈现逐渐下降趋势，lw、2w、3w、4w、6w时tlr4表达均高于c组（p<0. 05）,其中在4w时上升至最高（图五、六）。图五大鼠脊髓tlr4表达变化fig.5. the spinal cord of rats with tlr4 expression changestlr4/p-actintime(wk)注：与c组比较，*p<0.05图六大鼠脊髓tlr4表达变化电泳图b-actinfig.6. the spinal cord of rats with tlr4 expression changes e

31、lectrophoresis5糖尿病大鼠l4-6脊髓elisa检测tnf-ot和il-1 p表dm组l4-6脊髓 达tnf-a表达在lw、2w、3w、4w、6w、8w时比c组显著升高(p<0. 05)(图 七)。dm组l4-6舒髓il-lp在lw、2w、3w、4w、6w、8w吋比c组显著升高 (p<0. 05)(图八)。图七dm大鼠脊髓tnf-a表达变化fig.7.the spinal cord of rats with tnf-aexpression changestnf-a(pg/ml)注：与c组比较，*p<().()5图八大鼠脊髓il-ip表达变化 fig.8. the

32、 spinal cord of rats with il-lpcxpression changestime(wk)注：与c组比较，*p<0.05tlr4表达与机械痛阈、热痛阈的关系：将dm组ow、lw、2w、3w、4w所有 相对定量检测的l4-6脊髓胶质细胞tlr4表达与处死前所测得的机械痛阈和热痛阈进行spearman线性相关性分析显示：脊髓tlr4表达与机械痛阈呈负相关 (r=-0. 941)(p<0. 05),与热痛阈负相关(r=-0.907)(p<0. 05)。dm 组 6w、8w 脊 髓tlr4表达与机械捕阈和热痛阈无相关性。tlr4表达与tnf-a和il-ip的关

33、系：将dm组0w、lw、2w、3w、4w所有 相对定量检测的l4-6脊髓tlr4表达与tnf-a和il-lp进行spearman线性相关 性分析显示：tlr4表达与tnf-a呈正相关(r=0. 98)(p<0. 05),与il-lp呈正 相关(r=0. 87) (p<0. 05)。dm 组 6w、8w 脊髓 tlr4 表达与 tnf-a 和 il-lp 无相关性。tnf-a和il-lp与机械痛阈、热痛阈关系：将dm组所有和对定量检测的l4-6 脊髓tnf-a和il-ip表达与机械捕阈、热捕阈进行spearman线性相关性分析显 示ftnf-ot与机械痛阈成负相关(r=-0.929)

34、(p<0. 05), tnf-a与热痛阈成负相关 (r=-0.786)(p<0. 05) , il-lp 与机械痛阈成负相关(r=-0.750) (p<0. 05), il-lp 与 热痛阈成负相关(r=-0.643)(p<0. 05)。糖尿病的研究中通常选用stz诱导的糖尿病模型。本研究参照文献12介绍的 方法建立糖尿病神经病理性疼痛模型，设定指标：1.腹腔注射stz后lw,大鼠空 腹血糖16.7mrnol/l,毎日饮水、饮食及尿量明显增多，体重明显减轻，提示糖 尿病模型建立成功，2.腹腔注射stz后4w时诱发的机械痛阈值下降超过30%,糖 尿病祌经病理性疼痛模型建立

35、成功，保证了模型的可靠性。木研宄发现腹腔注射 stz后lw,大鼠空腹血糖2l6.7mmol/l,且出现了多饮、多食、多尿及体重减轻，在4w时机械痛阈值下降超过30%,这体现出dnp的典型特征，也说明造模成功。糖尿病神经病理性疼痛是糖尿病最常见的慢性并发症中之一，50-60%的糖 尿病患者并发了糖尿病神经病理性疼痛。糖尿病神经病理性疼痛常表现为自发性 疼痛、触诱发痛和痛觉过敏。在糖尿病大鼠神经病理性疼痛模型的行为学检测中 通常通过机械刺激检验触诱发痛、热刺激检验痛觉过敏，但还没有可信的方法测 量自发性疼痛。机械痛阈下降通常在造模后l-4w出现，约不降30%以上121。本实验显示机械痛阈造模2w后

36、下降，在4w至8w趋于平稳，在原来基础上下降了 约50%，与courteix等观察到的现象较为一致。对于糖尿病大鼠的热痛阈变化 目前存在争议，有人认为热痛阈降低in，有人认为热痛阈没有变化甚至是升高，5'161 ,热痛阈测量差异的确切原因尚不清楚，有学者认为这可能是由于动物种系 或测量方法不同所致m。本实验显示糖尿病组热痛阈在4w时下降，糖尿病组 8w时热痛阈虽然仍低于对照组，但是比6w时显著升高。tlr4是i型跨膜蛋白质，可广泛表达于哺乳动物免疫细胞和非免疫细胞。它是天然免疫细胞膜上最重要的模式识别受体，能识别内源性和外源性的危险因子启动免疫应答，近期有研究发现它在神经病理性疼痛中起

37、着重要的作用。tanga 等研宄发现在大鼠第5脊神经离断实验中神经损伤后脊髓胶质细胞tlr4mrna表达上调，随后乂证实tlr4表达是神经损伤导致脊髓胶质细胞活 化和热触觉过敏所必需的。lan等注入tlr4的小干扰rna抑制tlr4基因表 达减轻了大鼠骨癌后疼痛。wu等m也在小鼠慢性缩窄性损伤模型中发现注入tlr4的小干扰rna可以显著地减轻机械性感觉异常和热痛觉过敏。脊髓tlr4 的表达是否与糖尿病神经病理性疼痛相关尚不可知，本研究发现糖尿病大鼠脊髓 tlr4表达在糖以病组lw、2w、3w、4w呈现逐渐上升趋势且在4w时达到顶峰，随后逐渐下降，在8w时降至与对照组无显著差异。tlr4可以识别

38、细胞损伤或 死亡以后释放的内源性信号启动炎症反应。目前发现的能与tlr4相互作用的内 源性信号包括氧化低密度脂蛋q、热休克蛋q 90和70、高迁移率组蛋q、纤 维蛋白原单体等在糖尿病疾病中表达都增高i。糖尿病大鼠早期脊髓tlr4表达增高可能与内源性信号表达增高有关。tlr4活化后可激活两条下游信号通路， nf-kb和mapk信号转导通路，其中nf-kb通路级联反应可以引起炎性细胞因 子如tnf-a、il-lp、il-6的释放岡，炎性细胞因子诱发异常性疼痛或痛觉过敏 被广为认同24-25。zelenka m等人在大鼠坐骨神经附近注射生理剂量的tnf-(x和 il-ip就可以导致显著的神经病理性疼

39、痛26。在本次研宄中我们发现，糖尿病大 鼠l4-6脊髓表达tnf-ot和il-lp比对照组显著升高，tnf-a和il-lp分别与机 械痛阈和热痛阈呈负相关。pabreja k等人研究发现通过米诺环素抑制tnf-a和 il-ip的表达可以显著减轻糖尿病大鼠的异常性疼痛27。这些都说明tnf-a和il-ip是引起糖尿病大鼠神经病理性疼痛的重要因素。在本研宂显示糖尿病组1 w、2w、3w、4w时的脊髓tlr4表达与tnf-a和il-lp正相关，tlr4表达与 大鼠机械痛阈、热痛阈呈负相关，6w、8w脊髓tlr4表达下降，这说明糖尿病 大鼠早期神经病理性疼痛的机制可能是脊髓tlr4的高表达引起炎性细胞

40、因子 tnf-a和il-lp释放所引起的。4w以后tlr4表达下降，至8w与对照组无显著 差异，而炎性细胞因子tnf-a和il-lp仍然是高表达并ii与机械痛阈和热痛阈相 关，原因可能如下：1.在糖尿病病变过程中表达多种内源性物质除了激活tlr 通路外也可以激活其他炎症信号通路，如糖尿病屮高表达的糖化蛋內和高迁移率 组蛋內口j以激活糖化蛋內终产物受体(receptor for advanced glycation end products, rage) 21，而rage受体活化同样可以引起胶质细胞释放炎性细胞因子間。2.tlr家族有11个成员，除了 tlr4,其他的tlr受体如tlr2、tlr

41、3等同样 可能参与神经病理性疼痛的发病机制|29_3()|,在糖鉍病病变过程屮tlr2和tlr3 也可以高表达|31.32|，因此他们也可能是导致糖尿病神经病理性疼痛后期tnf-a 和il-ip高表达的因素。stz诱导的糖尿病模型热痛阈过敏通常只维持2-3个/ 17,随后由于糖尿病大鼠外周神经纤维丢失，痛阈过敏会变为痛觉减退閒，这可 能是8w时热痛阈回升的原因。综上所述，糖尿病大鼠早期脊髓tlr4表达增高导致炎性细胞因子tnf-a和il-lp的释放，炎性细胞因子tnf-a和il-lp是引起糖尿病大鼠神经病理性疼 痛的重要因素，因而tlr4表达增高与糖尿病大鼠早期神经病理性疼痛相关。参考文献1

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