发表论文蛋白质精氨酸甲基转移酶1在先天性巨结肠中的表达

1、蛋白质精氨酸甲基转移酶1在先天性巨结肠中的表达薛恩达1张明生11，山东宵聊城帘人民医院小儿外科【摘要】目的：检测蛋白质精氨酸甲基转移酶l（prmtl）在先天性巨结肠（hd）患 儿结肠狭窄段（hd组）及正常结肠组织（对照组）中的表达情况，探讨hd发病机制。方 法：20例hd组标本取自狭窄肠段（无神经节细胞肠段），20例对照组标本取自正常肠段 组织。通过western blot实验分析肠段prmt1蛋白表达量；通过免疫组织化学实验观察 prmt1在结肠各层组织细胞中的表达情况。结果：在对照组粘膜下层与肌间神经丛 prmt1显著表达，hd组没有prmt1的明显表达（p0. 05）,结论：结肠组织pr

2、mt1 表达量减少可能导致hd发生；prmt1作为一种标志物来诊断hd有一定价值。关键词：蛋白质精氨酸甲基转移酶1;先天性巨结肠；蛋白印迹实验；免疫组化abstractobjective： in this study，we will detect the prmt1 expression in the colon segments from hd patients and control group. we will study the pathogenesis ofhd methods： tissues samples were obtained from forty patients (t

3、wenty hd patients andtwenty non-hd patients) .western blot analysed the prmt1 protein levels in colon segments . immunohistochemistry was used to detect prmt1 expression in different layers of colon tissue cell from hd patients and control group.result： intensive prmt1 expression was detected in bot

4、h the submucosal and the myenteric plexuses from the control group. the colon segments of hd patients were not markedly labeled with prmt1(p<0.05 ) . conclusions： prmt1 expression should be used to investigate the pathogenesisand as a useful marker for the diagnosis of hd.key words： prmt1； hd ;we

5、stern blot;immunohistochemistry先天性巨结肠（hirschsprung's disease，简称hd）是一种肠神经系统 （enteric nervous system,简称ens）异常发育的痰病，又称为无神经节细胞 症。prmt1rxa或蛋白在不同的生物种类研究中均得到表达，如白鼠1、家鼠2、 鱼3等，mathioudaki等报道prmt1在结肠癌组织的细胞内的表达。在本研宂中, 将检测prmt1在hd患儿结肠狹窄段（hd组）及正常结肠组织（对照组）中的 表达情况，探讨hd发病机制。1. 材料与方法1.1标本取自聊城市人民医院及聊城市第二人民医院2014年

6、9月至2015年10 月间经手术治疗的患儿，先天性巨结肠组20例，年龄从4个月到5周岁，对照 组20例，年龄从1天到15周岁，正常结肠组织分别取自：6例肠套叠行肠切除 吻合术的患儿，4例自发性结肠穿孔切除修补术患儿，4例回盲部肿瘤切除术患 儿，2例肠扭转肠切除吻合术患儿，2例外伤性结肠破裂患儿，2例淋巴组织异 常增生患儿。1.2通过western blot实验分析肠段prmt1蛋白表达量；通过免疫组织化学实 验观察prmt1在结肠各层组织细胞中的表达情况。1.3数据采用spss 17.0软件处理，western blot凝胶图像prmt1表达强度采 用半定量数值（prmt1/p-actin）,

7、两组（hd组与对照组）间比较采用t检验； 分别计数两组样本免疫组化切片粘膜下层、肌层随机3个高倍镜视野细胞深染群 数之和，两组（hd组与对照组）间比较采用t检验。p<0. 05为差异有显著性。2结果2. 1 western blot 分析结果prmt1的表达水平通过western blot分析，如图（1、2）示，prmt1蛋白表 达量在对照组明显较大，然而在hd组表达量明显减少，而p-actin蛋白表达 基本相当。prmt1半定量（prmt1/p-actin）测定结果如表1, hd组明显少于 对照组（t= 一26. 852 p<0. 01）。对照组对照组hd组prmtl图1prmt

8、1、e-actin蛋白表达情况8 4 o.0. uuaf cj/usd0jiff）组对照组图2半定量prmt1表达量（prmtl/p-actin）分布图表1半定量prmt1表达量（jc土s）组别例数（n）prmt1的表达hd组200. 22±0. 06对照组200. 99±0. 11(t= -26.852p <0.01)2.2免疫组化结果对照组prmt1在结肠各层细胞核内都奋较为集中的表达，而在隐窝细胞和神 经丛的细胞质中右显著的表达，在肌细胞细胞质奋少量表达。prmt1在对照组粘 膜下层以及肠壁肌层间均有明显的表达（图4 1所示），甚至在hd组各层也奋部 分表达（图

9、3）。prmt1在两组粘膜层隐窝有明显表达，在粘膜下层毛细管内皮细 胞也有prmt1的表达（图3、4所示）。对照组粘膜下层及肌层间神经丛有prmt1 的较强的表达，而hd组粘膜下层与肌层间无神经丛，也就无prmt1的显著表达 （图3*所示），这也是western blot试验中hd组表达prmt1少的原因。两 组肌纤维细胞均有表达prmt1,细胞质较弱，细胞核较明显。hd组粘膜下层 及肌层深染细胞群数明显少于对照组（表2 p0.01,表3 p0.01）粘膜层x 200粘膜下层x 400肌肉层x400图3 hd组prmt1免疫组织化学染色粘膜层x 200粘膜下层x 400肌肉层x 400图4对照

10、组prmt1免疫组织化学染表2粘膜下层细胞深染群数量（随机3个髙倍镜视野总和a* 土s）组别例数（n）细胞深染群数量iid组200. 20±0.41对照组204. 15±1.09(t=-15.174 p<0.01)表3肠壁肌层细胞深染群数量（随机3个高倍镜视野总和x 土s）组别例数（n）细胞深染群数量hd组200. 15±0. 37对照组209. 15±1. 14(t=-33.119 p<0.01)3讨论通过本实验，发现了 prmt1在hd患儿结肠及正常患儿结肠的表达情况，在 不同类型的细胞屮prmt1有不同的表达。prmt1在正常肠壁粘膜不

11、层及肌间神经 从有明显的表达，关于prmt1在周围神经系统屮的表达情况国内鲜有研究，同时 也揭示/ prmt1在神经元细胞的发育与分化过程屮的重要作用。在肠道，no主 要是通过no合成酶在粘膜下层与肌间神经丛产生4，prmt1在该区域明显分布， 可能与no的合成有密切的联系。hd患儿狭窄段肠段的粘膜下层及肌层间祌经丛缺如可以通过prmt1染色来 确诊 he染色法、乙酰胆碱酯酶组织化学分析、基因免疫检测（s100、neun、 ret等）等方法己经被广泛应用5"7，prmt1在粘膜隐窝细胞和神经丛均有较为显 著的表达，prmt1可以作为hd诊断的标志物。目前临床hd的病理诊断标志物只 有

12、特定的神经元细胞，这就耍求阴性表达（神经节细胞缺如）必须是在成功的免 疫组化方法的前提下。而prmt1在正常肠段和神经节细胞缺乏肠段的粘膜隐窝细 胞均有显著表达，因此可以成为内部的阳性对照。prmt1可催化的蛋白质甲基化，在细胞分化屮产生重要的作用。比如，在神 经细胞分化过程屮神经生长因子特异性信号转导激活prmt1,导致丫蛋a质甲基 化状态改变。prmt1/btg蛋白在精氨酸甲基化介导的信号通路及神经分化过程屮 发挥重要的作用。prmt1在神经元细胞的分化、发育及成熟过程屮起到重要作用， 先天性巨结肠是一种肠神经系统发育障碍的疾病，prmt1的缺乏可能导致hd的发 生，有助于阐明hd的发病机

13、制。prmt1作为一种标志物来诊断hd有一定价值。参考文献12 lin wj，gary jd，yang mc，clarke s. the mammalian immediate-early tis21 protein and the leukemia-associated btg1 protein interact with a protein-arginine n-methyltransferase. j biol chem 1996, 271: 15034-44.2 tang j，frankel a, cook rj，et al.prmtl is the predominant type

14、i protein arginine methyltrans- ferase in mammalian cells. j biol chem 2000,275: 7723-30.3 dong cw，zhang yb，lu aj，et al. molecular characterisation and inductive expression of afish protein arginine methyltransferase 1 gene in response to virus infection. fish shellfish immunol ,2007,22: 380-93.4 li

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